8.3  Các đặc tính sinh hóa

Các loài và phân loài Salmonella được xác định dựa trên các phép thử sinh hóa khác nhau. Trong Bảng 2 đưa ra các đặc tính khác nhau. Xem Tài liệu tham khảo [9] và Phụ lục C để biết thêm chi tiết.

Bảng 2 - Các đặc tính sinh hóa của các loài và phân loài Salmonella (Tài liệu tham khảo [9])

Loài

S. enterica

S. bongori

Phân loài

enterica

salamae

...

...

...

diarizonae

houtenae

indica

Dulcitol

+

+

-

-

-

...

...

...

+

ONPG^a (2 h)

-

-

+

+

-

d

+

...

...

...

-

+

+

+

-

-

-

Gelatinase

-

...

...

...

+

+

+

+

-

Sorbitol

+

+

+

...

...

...

+

-

+

Phát triển với KCN^b

-

-

-

-

+

...

...

...

+

L(+)-tartrate^c

+

-

-

-

-

-

-

...

...

...

-

+

-

+

+

+

+

g-Glutamyltransferase

+^e

...

...

...

-

+

+

+

+

β-Glucuronidase

d

d

-

...

...

...

-

d

-

Mucate

+

+

+

- (70 %)

-

...

...

...

+

Salicin

-

-

-

-

+

-

-

...

...

...

-

-

- (75 %)

+ (75 %)+

-

d

-

Dung giải bởi pha O1

+

...

...

...

-

+

-

+

d

+ ≥ 90 % phản ứng dương tính;

- ≥ 90 % phản ứng âm tính;

d các phản ứng khác nhau của các serovar khác nhau;

^a o-Nitrophenyl-β-D-galaclopyranoside (phép thử [β-galactosidase].

...

...

...

^c = D-Tartrat, Paratyphi B:-, Paratyphi B biovar Java:+

^e = Typhimurium:d. Dublin:-.

8.4  Đặc tính kháng nguyên

8.4.1  Yêu cầu chung

Các đặc tính kháng nguyên quan trọng của Salmonella đối với các phép thử huyết thanh được chia thành ba loại chính như sau:

- Kháng nguyên-O, còn gọi là kháng nguyên thân;

- Kháng nguyên-H, còn gọi là kháng nguyên lông;

- Kháng nguyên-Vi, còn gọi là kháng nguyên vỏ.

Các công thức kháng nguyên của Salmonella spp. gồm có ba typ kháng nguyên sau đây: kháng nguyên-O, kháng nguyên-Vi (nếu có]: kháng nguyên-H của pha thứ nhất: kháng nguyên-H của pha thứ hai. Ví dụ: công thức kháng nguyên của Salmonella Paratyphi C là: 6,7[Vi]:c:1,5, với kháng nguyên-O:6 và O:7; với kháng nguyên-Vi, có thể có mặt hoặc không có mặt (ký hiệu bởi các dấu ngoặc vuông), với kháng nguyên-H H:c của pha thứ nhất, với các kháng nguyên-H H:1 và H:5 của pha thứ hai.

...

...

...

Kháng nguyên này bao gồm thành phần vách tế bào và các chất chính là polysaccharid, protein và phospholipid. Kháng nguyên-O rất bền và có thể chịu được nhiệt độ đến 100 ^oC trong 150 min, xử lý bằng etanol 95 % thể tích hoặc axit loãng (Tài liệu tham khảo [16]).

Phản ứng của kháng nguyên-O với kháng huyết thanh làm ngưng kết hạt. Trước đây, trong tài liệu của Kauffmann-White (Tài liệu tham khảo [9]) các kháng nguyên-O được phân loại thành các nhóm kháng nguyên-O. Các nhóm này được đặt tên với chữ cái La Mã bất đầu với nhóm A, trong đó gồm có kháng nguyên O:2 đến nhóm Z có chứa kháng nguyên O:50. Vì có nhiều các kháng nguyên-O, nên các kháng nguyên còn lại không được đưa váo nhóm, nhưng đã được đặt tên thành các kháng nguyên-O từ O:51 đến O:67. Ngày nay, mỗi nhóm O sử dụng O-yếu tố điển hình được dùng nhiều hơn. Các chữ cái này đã được giữ lại và được đưa vào trong dấu ngoặc đơn, ví dụ: O:4 [B] (Tài liệu tham khảo [9]). Trong Bảng 3 đưa ra các tên gọi cũ và mới.

Bảng 3 - Các nhóm huyết thanh Salmonella (tên gọi cũ) và các kháng nguyên-O có liên quan (tên gọi mới)

Nhóm

Kháng nguyên-O

Nhóm

Kháng nguyên-O

Nhóm

Kháng nguyên-O

...

...

...

2

G₁-G₂

13

Q

39

B

4

H

6,14

...

...

...

40

C₁(C₄)^a

6,7

I

16

S

41

C₂, C₃

8

...

...

...

17

T

42

D₁

9

K

18

U

43

...

...

...

9,46

L

21

V

44

D₃

9,46,27

M

28

...

...

...

45

E₁(E₂, E₃)^b

3,10

N

30

X

47

E₄

1,3,19

...

...

...

35

Y

48

F

11

P

38

Z

50

...

...

...

^b E₂ và E₃ đã được gộp vào E₁.

8.4.3  Kháng nguyên-H (kháng nguyên lông)

Kháng nguyên này nằm trên sợi lông và các thành phần chính là protein. Kháng nguyên này không bền bằng kháng nguyên-O, dễ bị phân hủy trong ancol, axit và nhiệt độ trên 60 ^oC, nhưng có khả năng chịu được dung dịch formalin 0,5 % thể tích (Tài liệu tham khảo [16]).

Phản ứng của kháng nguyên-H với kháng huyết thanh làm ngưng kết bông. Nhiều Salmonella spp. có hai pha kháng nguyên-H, nhưng các biến thể một pha và ba pha chưa được biết. Pha đầu tiên được gọi là pha đặc hiệu và pha thứ hai được gọi là pha không đặc hiệu. Pha đầu được ký hiệu bằng chữ thường từ a đến z. Tuy nhiên, từ khi nhận biết kháng nguyên-z, thì nhiều kháng nguyên-H mới đã được phát hiện và được đặt tên z₁, z₂, z₃...z₉₁.

Các ví dụ về các serovar một pha là:

- Salmonella Paratyphi A: 1,2,12:a:[1,5] với H:a đối với pha đầu tiên, trong dấu ngoặc vuông là pha thứ hai (H:1,5) có thể có mặt hoặc không có mặt;

- Salmonella Typhi: 9,12,[Vi]:d:-; với H:d đối với pha đầu;

- Salmonella Derby: 1,4,[5], 12:f,g[1,2]; với H:f,g đối với pha đầu tiên, khi đó pha thứ hai (H:1,2) có thể có hoặc không có mặt;

- Salmonella Enteritidis: 1,9,12:g,m:-; với H:g,m đối với pha đầu. Ngoài các H:g,m, một số chủng có thể có H:p, hoặc H:f, hoặc H:t. Các chủng đặc biệt có thể có kháng nguyên H:1,7 là pha thứ hai;

...

...

...

CHÚ THÍCH 1: Các yếu tố-O gạch chân được xác định bằng biến trạng thực khuẩn. Chúng chỉ có mặt nếu chủng cấy được dung giải bằng thể thực khuẩn biến trạng tương ứng (Tài liệu tham khảo [2]).

CHÚ THÍCH 2: Các yếu tố-O hoặc -H trong ngoặc vuông có thể có mặt hoặc không có mặt, mà không liên quan đến thực khuẩn thể tiến trạng (Tài liệu tham khảo [2]).

CHÚ THÍCH 3: Các chủng Salmonella Derby và Salmonella Enteritidis rất hiếm gặp. Có thể cần chuyển đổi pha đề phát hiện các chủng hiếm gặp này. Tuy nhiên, điều này chỉ cần thiết với những trường hợp nhất định [ví dụ trong trường hợp sai lệch nguồn và/hoặc trường hợp có di chuyển (đặc biệt)].

8.4.4  Kháng nguyên-Vi (kháng nguyên vỏ)

Kháng nguyên này là kháng nguyên vỏ và có thể che khuất các kháng nguyên-O làm cho các vi khuẩn không ngưng kết với kháng huyết thanh-O. Thành phần chính của kháng nguyên-Vi là polysaccharid. Các chủng Salmonella có kháng nguyên-Vi độc hơn so với các chủng không có kháng nguyên-Vi. Kháng nguyên-Vi có thể chỉ có mặt trong ba Salmonella serovar:

- Salmonella Typhi: 9,12, [Vi]:d:-;

- Salmonella Paratyphi C: 6,7,[Vi]:c:1,5;

- Salmonella Dublin: 1,9,12, [Vi]:g,p:-.

Trong các dấu ngoặc vuông cho thấy có thể có hoặc không có mặt kháng nguyên-Vi.

...

...

...

9  Quy trình xác định typ huyết thanh Salmonella

9.1  Yêu cầu chung

Trước khi bắt đầu xác định typ huyết thanh, cần khẳng định sinh hóa rằng chủng phân lập được thuộc chi Salmonella (như quy định trong ISO 6579-1). Mặc dù các kháng nguyên-H là đặc hiệu cho Salmonella, thì một số kháng nguyên-O thường gặp ở các chi khác nhau của Enterobacteriaceae (ví dụ: Salmonella, Citrobacter, Hafnia).

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng các quy trình khác để khẳng định rằng chủng phân lập được thuộc chi Salmonella, với điều kiện là quy trình thay thế này đã được xác nhận (xem TCVN 6404 (ISO 7218)].

Mỗi nhà cung cấp các kháng huyết thanh sản xuất ra các bộ kháng huyết thanh riêng, kèm theo hướng dẫn sử dụng. Do đó, không thể đưa ra một bộ hướng dẫn cho việc xác định typ huyết thanh, vì cần phải thực hiện theo đúng hướng dẫn của nhà cung cấp để có được kết quả tối ưu. Một số nhà sản xuất cung cấp các kháng huyết thanh (hỗn hợp của nhiều kháng huyết thanh-O hoặc kháng huyết thanh-H) rất hữu ích cho việc xác định typ huyết thanh chưa biết. Khi chủng ngưng kết với kháng huyết thanh hỗn hợp, thì có thể tiếp tục thử nghiệm với nhóm kháng huyết thanh và/hoặc chỉ với loại kháng huyết thanh hỗn hợp dương tính. Khi cần nhấn mạnh các serovar nhất định và khả năng để chỉ ra các serovar khác theo Salmonella spp. thì có thể tiến hành ngưng kết ngay chỉ với kháng huyết thanh đơn giá cụ thể của serovar có liên quan.

Trong Phụ lục B đưa ra quy trình chung về việc xác định typ huyết thanh chưa biết của chủng phân lập Salmonella.

9.2  Ví dụ về quy trình xác định typ huyết thanh cho năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

9.2.1  Yêu cầu chung

Trong ví dụ dưới đây mô tả quy trình xác định typ huyết thanh cho năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (xem Phụ lục D). Trong Bảng 4 đưa ra các chủng này với công thức kháng nguyên của chúng.

...

...

...

Bảng 4 - Công thức kháng nguyên của năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

Tên

Kháng nguyên-O^b

Kháng nguyên-H

Pha 1

Pha 2

Salmonella Typhimurium

1,4,[5]12

i

...

...

...

Salmonella Enteritidis^a

1,9,12

g,m

-

Salmonella Infantis

6,7,14

r

1,5

Salmonella Virchow

...

...

...

r

1,2

Salmonella Hadar

6,8

Z₁₀

e,n,x

^a Ngoài các yếu tố H:g,m, một số chủng có thể có yếu tố H:p hoặc H:f hoặc H:t. Trừ các chủng có thể có kháng nguyên H:1,7 là pha thứ 2 (Tài liệu tham khảo [9]).

^b Các yếu tố O gạch chân được xác định bằng biến trạng thực khuẩn. Chúng chỉ có mặt nếu chủng cấy được dung giải bằng thể thực khuẩn biến trạng tương ứng (Tài liệu tham khảo [9]).

9.2.2  Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella

...

...

...

9.2.3  Kiểm tra phản ứng tự ngưng kết

Ví dụ về phép thử kiểm tra phản ứng tự ngưng kết được mô tả sau đây. Có thể sử dụng các phương pháp khác. Thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

- Cho một giọt nước muối (có thể thay đổi lừ NaCI 8,5 g/l đến NaCI 35 g/l, nồng độ cao hơn có thể nhạy hơn) trên lam kính (6.4).

- Chuyển một lượng nhỏ chủng cấy vi khuẩn (ví dụ: có thể lấy một lượng 1 µl bằng que cấy dùng một lần) sang lam kính và trộn với giọt nước muối.

- Nghiêng nhẹ lam kính qua lại. Tùy thuộc vào nhà sản xuất và/hoặc nồng độ muối, thường khoảng 5 s đến 60 s.

- Đánh giá huyền phù. Khi có mặt các hạt trong huyền phù chứng tỏ có sự tự ngưng kết. Các chủng có phản ứng dương tính trong phép thử tự ngưng kết rất khó kiểm tra thêm để xác định typ huyết thanh. Đối với các chủng tự ngưng kết, không thể thực hiện được phép thử kháng nguyên-O. Tuy nhiên, đôi khi vẫn có thể điều tra về các kháng nguyên-H.

Nếu một chủng cho thấy tự ngưng kết, có thể thử trên một hoặc hai cách dưới đây trên cùng một khuẩn lạc và/hoặc trên các khuẩn lạc khác.

- Hòa khuẩn lạc trong nước vô trùng thay vì trong dung dịch nước muối và tiến hành quy trình tự ngưng kết như trên.

- Cấy các chủng trên môi trường thạch bán đặc như mối trường thạch Rappaport Vassiliadis cải biến (MSRV) (theo quy định trong ISO 6579-1) và sử dụng khuẩn lạc từ thạch bán đặc để thực hiện quy trình tự ngưng kết như trên.

...

...

...

9.2.4  Ngưng kết với kháng huyết thanh-O

Các hướng dẫn sử dụng của các kháng huyết thanh có thể khác nhau giữa các nhà sản xuất. Do đó, điều quan trọng là luôn tuân thủ các hướng dẫn của nhà sản xuất.

Hầu hết các nhà sản xuất sử dụng phương pháp ngưng kết lam kính để phát hiện các kháng nguyên-O. Trong phương pháp này, trộn một giọt huyết thanh với huyền phù vi khuẩn (trực tiếp từ đĩa, ống hoặc canh thang) trên lam kính. Nghiêng nhẹ lam kính qua lại. Sau đó, quan sát sự ngưng kết trên lam kính. Sự có mặt các hạt chứng tỏ phản ứng dương tính.

Đối với các nhà sản xuất khác nhau, có thể có những thay đổi trong cách tiến hành như sau:

- Kích thước của giọt trên lam kính (ví dụ: 25 µl hoặc một “giọt”];

- Cách trộn kháng huyết thanh với vi khuẩn trên lam kính (vi khuẩn được lấy trực tiếp từ môi trường thạch hoặc huyền phù, kháng huyết thanh được cho trực tiếp trên lam kính hay được cho vào huyền phù vi khuẩn);

- Thời gian nghiêng trượt lam kính (có thể dao động từ 5 s đến 60 s];

- Cách quan sát sự ngưng kết (phóng đại hay không, nền tối hoặc ánh sáng bình thường];

- Giải thích các kết quả (đọc các chú thích liên quan đến những hạn chế của quy trình].

...

...

...

Sau khi ngưng kết với kháng nguyên-O, tiến hành ngưng kết với kháng nguyên-H. Salmonella thường có hai loại kháng nguyên-H (pha 1 và pha 2). Nếu một pha-H được tìm thấy âm tính với các chủng hai pha, thì cần thực hiện phương pháp đảo pha. Pha-H chính bị khống chế bằng phương pháp đảo pha. Bằng cách khống chế pha-H chính, thì pha-H thứ hai có thể được thể hiện và xác định.

Phương pháp thường được sử dụng để đảo pha là phương pháp của Sven Gard, xem 9.2.7. Đối với việc này, kháng huyết thanh đảo pha cụ thể được cho vào môi trường thạch và chủng Salmonella được cấy thành điểm trên đĩa. Môi trường thạch phải đủ mềm để cho Salmonella di chuyển dễ dàng trong môi trường. Nồng độ thạch trong môi trường có thể thay đổi từ 0,5 % đến 1 % khối lượng (tùy thuộc vào nồng độ gel của thạch). Ví dụ sự di chuyển trên bề mặt môi trường được đưa ra trong A.3. Các ví dụ khác về đảo pha được đưa ra trong Phụ lục F.

Để kiểm tra về sự ngưng kết, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

9.2.6  Phép thử ngưng kết để xác định typ huyết thanh của năm serovar Salmonella ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng

9.2.6.1  Yêu cầu chung

Để phát hiện năm serovar Salmonella đề cập trong Bảng 4, cần đến các kháng huyết thanh-O và kháng huyết thanh-H sau đây:

O:4, O:5, O:6 (O:61 hoặc O:6,7 hoặc O:6,14,24), O:7. O:8, O:9 và O:46.

H:i, H:2, H:G hoặc H:g (đơn giá), H:m, H:q, H:s, H:t, H:r, H:5, H:z₁₀ và H:x.

Để xác định các typ huyết thanh của các chủng Salmonella theo thứ tự nêu trong Bảng 4, thực hiện quy trình quy định trong 9.2.6.2 đến 9.2.6.5 (xem sơ đồ tại Phụ lục D).

...

...

...

9.2.6.2  Nếu O:4 dương tính

Ngưng kết với O:5. Kết quả có thể là dương tính hay âm tính đối với Salmonella Typhimurium, vẫn còn có thông tin có thể liên quan đến các mục đích dịch tễ.

Ngưng kết với các kháng huyết thanh H:i và H:2 (có thể cần đảo pha).

Các serovar là chủng Typhimurium nếu cả hai phản ứng này là dương tính.

Ngưng kết với O:12 là không cần thiết để chứng tỏ chủng phân lập Salmonella Typhimurium, vì O:4 dương tính chứng tỏ có mặt O:12. Tương tự, việc phát hiện kháng nguyên H:1 không có khả năng phân biệt và không cần phải kiểm tra bổ sung.

9.2.6.3  Nếu O:9 dương tính

Ngưng kết với kháng huyết thanh H:G (hỗn hợp) hoặc với kháng huyết thanh H:g (kháng thể đơn giá).

Nếu phản ứng này dương tính, tiến hành ngưng kết tiếp với kháng huyết thanh H:m.

Nếu kết quả dương tính, ngưng kết với các kháng huyết thanh H:q và H:s để kiểm chứng âm.

...

...

...

CHÚ THÍCH: Ngoài các yếu tố H:g,m, một số chủng Salmonella Enteritidis có thể cho phản ứng dương tính với kháng huyết thanh H:p hoặc H:f hoặc H:t. Tuy nhiên, các chủng này là rất hiếm. Trừ các chủng đặc biệt có thể có kháng nguyên H:1,7 như là pha thứ hai

9.2.6.4  Nếu O:7 dương tính

Ngưng kết với kháng nguyên H:r, H:2 và H:5 (có thể cần đảo pha).

Nếu H:r và H:2 dương tính, serovar của chủng là: Virchow.

Nếu H:r và H:5 dương tính, serovar của chủng là: Infantis.

Việc phát hiện kháng nguyên H:1 không có khả năng phân biệt và không cần phải kiểm tra bổ sung.

9.2.6.5  Nếu O:8 dương tính

Ngưng kết với các kháng nguyên H:z₁₀ và H:x.

Nếu cả hai đều dương tính, ngưng kết tiếp với các kháng huyết thanh O:6₁ hoặc O:6,7 hoặc O:6,14,24.

...

...

...

Một số mẻ kháng huyết thanh O:6,7 không phản ứng với chủng O:6,8. Khi mua kháng huyết thanh này, cần chắc chắn rằng có phản ứng với chủng O:6,8 (hỏi các nhà sản xuất).

CHÚ THÍCH: Dạng biến thể khuẩn lạc có thể xảy ra với các biểu hiện của kháng nguyên O:6₁ bởi một số serovar nhóm huyết thanh C₂ (Tài liệu tham khảo [11]). Vì lý do đó, không phải lúc nào cũng có thể nhận biết được, ví dụ Salmonella Hadar và Salmonella Istanbul như các serovar rõ ràng.

9.2.7  Ví dụ về đảo pha sử dụng phương pháp Sven Gard

Ví dụ này mô tả việc đảo pha dùng cho việc xác định typ huyết thanh Salmonella Typhimurium. Nhìn chung, phương pháp này cũng áp dụng được cho các serovar Salmonella khác.

Khi O:4 và H:i dương tính, còn H:2 âm tính, thì chuẩn bị một đĩa thạch di chuyển (xem A.3 hoặc F.1), với kháng-H:i (ví dụ: hỗn hợp huyết thanh đảo pha có chứa H:i). Chấm chủng vi khuẩn vào giữa đĩa thạch. Ủ đĩa từ 34 °C đến 38 °C (6.1) qua đêm (khoảng 18 h).

Sau khi ủ, tàm lại việc ngưng kết chủng với kháng nguyên H:2.

Nếu H:2 lại âm tính, ngưng kết tiếp với H:i.

Nếu H:i âm tính hoặc có phản ứng yếu, thì chủng này không phải là Salmonella Typhimurium.

Nếu H:i cho phản ứng dương tính (mạnh), thì lặp lại việc đảo pha. Chuẩn bị lại đĩa thạch với kháng-H:i và lấy vi khuẩn từ điểm xa nhất mọc lan trên đĩa thạch, đảo pha thứ nhất để cấy vào đĩa thứ hai. Lặp lại quy trình đảo pha như trên.

...

...

...

CHÚ THÍCH 2: Cũng có thể có các biến thể một pha của Salmonella Typhimurium, ví dụ do thiếu hoặc không thể hiện pha H thứ hai 1.4.[5]12:i:-. Trong khi xác định typ huyết thanh biến thể này, có thể phải lặp lại một lần hoặc nhiều lần việc đảo pha để loại trừ sự có mặt của pha thứ hai. Ngoài ra, cò thể sử dụng phương pháp phân tử để khẳng định có phải biến thể của Salmonella Typhimurium hay không.

10  Kiểm soát chất lượng

Huyết thanh được sử dụng để ngưng kết phải trong (trừ các kháng huyết thanh được sử dụng để thử nghiệm latex). Luôn luôn phải kiểm tra huyết thanh trước khỉ sử dụng. Trường hợp bị đục, thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Các quy trình kiểm soát chất lượng của quy trình xác định typ huyết thanh như sau:

- Mỗi tuần làm việc chọn hai chủng (hoặc số lượng chủng chiếm khoảng 2 % khối lượng chủng phân lập được). Mỗi chủng được cấy hai lần. Các chủng cấy chuyển được xử lý như là hai chủng mới phân lập để xác định typ huyết thanh. Sau khi hoàn thành công việc, các kết quả của hai chủng và các chủng cấy chuyển được so sánh về sự khác biệt. Nếu có bất kỳ một sự khác biệt nào, thì sẽ được nghiên cứu tiếp.

- Phòng thử nghiệm lưu giữ đầy đủ chủng gốc các serovar Salmonella đặc hiệu (ví dụ: từ bộ sưu tập chủng cấy hoặc từ các nghiên cứu so sánh liên phòng). Chủng lưu gốc này, định kỳ (ví dụ: hàng tuần) chọn một hoặc hai serovar của 10 serovar thường gặp nhất trong phòng thử nghiệm để kiểm tra quy trình xác định typ huyết thanh. Các serovar được sử dụng để thực hiện việc kiểm soát chất lượng có thể thay đổi hàng tuần để đảm bảo rằng trong một khoảng thời gian các kháng huyết thanh khác nhau đều đã được kiểm tra.

- Phải kiểm tra khả năng xác định typ huyết thanh giữa các phòng thử nghiệm khác nhau. Để thực hiện, nên thường xuyên tham gia vào các nghiên cứu so sánh liên phòng, khi có thể.

11  Báo cáo kết quả

Đối với các chủng phân lập thuộc S. enterica subsp. enterica, thì báo cáo tên (đầy đủ) và khi có thể/khi cần kèm theo công thức kháng nguyên. Đối với các loài (phân loài) khác, thì báo cáo công thức kháng nguyên tìm thấy được.

...

...

...

Kháng nguyên-O (cách nhau bằng dấu phẩy), kháng nguyên-Vi (nếu có): các kháng nguyên-H của pha đầu tiên (cách nhau bằng dấu phẩy): các kháng nguyên-H của pha thứ hai (nếu có; cách bằng dấu phẩy); kháng nguyên-H của pha thứ ba (nếu có).

Ví dụ, theo hệ thống White-Kauffmann-Le-Minor (Tài liệu tham khảo [9]), công thức Kháng nguyên đầy đủ của Salmonella Typhimurium là: 1,4,[5],12:i:1,2.

Với các kháng nguyên-O O:1,4,[5],12; trong đó yếu tố O được gạch dưới được xác định bằng thể thực khuẩn biến trạng và chỉ xuất hiện nếu chủng cấy được dung giải bằng thực khuẩn thể biến trạng tương ứng và trong dấu ngoặc vuông chỉ ra rằng có thể có hoặc không có mặt yếu tố liên quan đến thực khuẩn thể biến trạng (Tài liệu tham khảo [9]); với các kháng nguyên-H, H:i đối với pha thứ nhất và H:1,2 đối với pha thứ hai.

Để báo cáo chính thức, công thức kháng nguyên của chủng phân lập, tốt nhất là không có ngoặc vuông hoặc không có gạch dưới. Báo cáo công thức kháng nguyên đã được xác định, ví dụ 4,12:i:1,2.

Đối với các phân loài khác của S. enterica, loài có serovar phù hợp được thể hiện bằng ký hiệu sau đây (Tài liệu tham khảo [9]):

II đối với serovar S. enterica subsp. salamae;

llla đối với serovar S. enterica subsp. arizonae;

lllb đối với serovar S. enterica subsp. diarizonae;

IV đối với serovar S. enterica subsp. houtenae;

...

...

...

Ví dụ về báo cáo kết quả của các loài khác với S. enterica subsp. enterica là S. II 30:z₁₀:e,n,x,z₁₅.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thành phần và chuẩn bị môi trường nuôi cấy và thuốc thử

A.1  Yêu cầu chung

Trong Phụ lục này đưa ra các môi trường nuôi cấy liên quan đến các phép thử sinh hóa (xem Phụ lục C). Thành phần của các môi trường nuôi cấy nêu trong phụ lục này được lấy làm ví dụ. Môi trường nuôi cấy có các tên gọi tương tự có thể được nêu trong tài liệu hoặc được bán sẵn với các thành phần hơi khác nhau. Do đó, điều quan trọng đối với mỗi phép thử sinh hóa cần kiểm tra các phản ứng của môi trường nuôi cấy với các chủng kiểm chứng dương tính và âm tính điển hình.

ĐIỀU QUAN TRỌNG - Nếu môi trường nuôi cấy hoặc thuốc thử được chuẩn bị từ môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh khô hoặc thuốc thử hoặc môi trường nuôi cấy đã chuẩn bị sẵn được sử dụng, thì thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất về chuẩn bị, điều kiện bảo quản, hạn sử dụng và cách sử dụng.

Thời hạn sử dụng của các môi trường nuôi cấy nêu trong phụ lục này đã được thể hiện trong một số tài liệu nghiên cứu. Người sử dụng cần kiểm tra xác nhận điều này trong các đều kiện bảo quản của mình [xem TCVN 8128 (ISO 11133)].

A.2  Thạch dinh dưỡng

...

...

...

Chất chiết từ thịt

3,0 g

Pepton^a

5,0 g

Natri clorua (NaCI)(tùy chọn)

5,0 g

Thạch

từ 9g đến 18 g^b

Nước

...

...

...

^a Ví dụ: thủy phân casein bằng enzym

^b Tùy thuộc vào sức đông của thạch.

A.2.2  Chuẩn bị

Đun nóng để hòa tan các thành phần trong nước.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy vào bình (6.6) có dung tích thích hợp.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) ở 121 °C trong 15 min.

...

...

...

Bảo quản các đĩa đã rót (hướng lên trên), tránh hút ẩm và để ở nơi tối ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng. Nếu cần, làm khô các đĩa trước khi sử dụng.

A.3  Môi trường thạch - Sven Gard (ví dụ)

A.3.1  Ví dụ 1 (Tài liệu tham khảo [16])

Sử dụng thạch dinh dưỡng với nồng độ thạch cải biến

Cần xác định nồng độ thạch của thạch dinh dưỡng dùng cho đảo pha H trong đĩa Petri. Nồng độ này có thể thay đổi từ 0,5 % đến 1 % phần khối lượng, tùy thuộc vào mẻ thạch được sử dụng. Môi trường thạch yêu cầu phải đủ mềm cho Salmonella di chuyển dễ dàng trên khắp môi trường sau khi ủ qua đêm từ 34 °C đến 38 °C (6.1). Các thử nghiệm sơ bộ, không bổ sung kháng huyết thanh, do đó cần sử dụng môi trường thạch dinh dưỡng (pH 7,4) được chuẩn bị cho mục đích đó hoặc thạch dinh dưỡng của phòng thử nghiệm thông thường, được làm bán đặc bằng cách bổ sung canh thang với tỷ lệ thích hợp để qua đêm. Thể tích cần cho một đĩa Petri 10 cm là 30 ml.

Việc di chuyển trên bề mặt thạch sẽ dễ hơn nếu bổ sung natri desoxycholate (0,3 g/l) vào môi trường (natri desoxycholate kích thích sự di chuyển), xem A.3.2.

A.3.2  Ví dụ 2

A.3.2.1  Thành phần

Chất chiết từ thịt

...

...

...

Chất chiết nấm men

1,0 g

Canh thang đậu tương trypto-casein

30,0 g

Glucose

0,35 g

Natri desoxycholat

1,0 g

Thạch

...

...

...

Nước

1 000 ml

^a Tùy thuộc vào sức đông của thạch. Có thể cần cải thiện để xác định nồng độ của thạch đối với môi trường cần thiết cho sự di chuyển tối ưu của Salmonella.

A.3.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,6 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy vào bình (6.6) có dung tích thích hợp.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 110 °C trong 20 min.

Làm nguội thạch đến khoảng từ 47 °C đến 50 °C (6.8), hoặc bảo quản trong chai đậy kín ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

...

...

...

- bổ sung một giọt kháng huyết thanh có liên quan (SG1 đến SG6) vào môi trường tan chảy và trộn đều;

- rót khoảng 10 ml vào các đĩa Petri đường kính 55 mm (6.7) hoặc rót khoảng 20 ml vào các đĩa Petri đường kính 90 mm.

A.4  Canh thang malonat

A.4.1  Thành phần (Tài liệu tham khảo [14])

Amoni sulfat

2,0 g

Dikali phosphat

0,6 g

Monokali phosphat

...

...

...

Natri clorua

2,0 g

Natri malonat

3,0 g

Bromothymol xanh

0,025 g

Nước

1 000 ml

A.4.2  Chuẩn bị

...

...

...

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 6,7 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ống cho phép có đủ oxy để xảy ra phản ứng malonat. Ví dụ, sử dụng các ống kích thước xấp xỉ 22 mm x 220 mm.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 121 °C trong 15 min.

Bảo quản ở nơi tối ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.5  Canh thang Dulcitol (Tài liệu tham khảo [2])

A.5.1  Môi trường hoàn chỉnh

A.5.1.1  Thành phần

Chất chiết từ thịt

3,0 g

...

...

...

10,0 g

Natri clorua

5,6 g

Chất chỉ thị Andrade (A.5.2)

10 ml

Dung dịch Dulcitol (A.5.3)

50 ml

Nước

1 000 ml

...

...

...

A.5.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ống có dung tích danh nghĩa 15 ml.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 121 °C trong 15 min.

Bảo quản ở nơi tối ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.5.2  Chất chỉ thị Andrade

A.5.2.1  Thành phần (sau Andrade-Penny năm 1895; trích dẫn trong Tài liệu tham khảo [7])

Fuchsin axit

...

...

...

Natri hydroxit (1,0 mol/l)

0,5 g

Nước

1 000 ml

A.5.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan fuchsin trong nước, thêm natri hydroxit. Nếu sau vài giờ mà fuchsin không mất màu thì thêm 1 ml hoặc 2 ml natri hydroxit. Thuốc thử này có hạn sử dụng dài và cần chuẩn bị một lượng đủ lớn để dùng trong nhiều năm.

A.5.3  Dung dịch Dulcitol

A.5.3.1  Thành phần

Dulcitol

...

...

...

Nước

1 000 ml

A.5.3.2  Chuẩn bị

Hòa tan dulcitol trong nước.

Tiệt trùng bằng cách lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,22 µm.

Bảo quản ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.6  Dung dịch ONPG (0,013 3 mol/l) (Tài liệu tham khảo [2])

A.6.1  Môi trường hoàn chỉnh

A.6.1.1  Thành phần

...

...

...

0,08 g

Dung dịch mononatri phosphat (NaH₂PO₄.H2O; A.6.2)

5 ml

Nước

15 ml

A.6.1.2  Chuẩn bị

Hòa tan ONPG trong nước ở khoảng 37 °C. Thêm dung dịch NaH₂PO₄ 1,0 mol/l (A.6.2.1). Dung dịch phải không màu. Bảo quản dung dịch ở 5 °C (6.3).

Trước khi sử dụng, làm ấm một lượng thích hợp (đủ cho số lượng phép thử) dung dịch ONPG đến khoảng 37 °C.

A.6.2  Dung dịch mononatri phosphat (1,0 mol/l)

...

...

...

NaH₂PO₄.H₂O

6,9 g

Dung dịch NaOH, 300 g/l

3 ml

Nước

45 ml

A.6.2.2  Chuẩn bị

Hòa tan NaH₂PO₄.H₂O trong nước. Thêm dung dịch NaOH 300 g/l và chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 (ở 25 °C). Thêm nước đến 50 ml và bảo quản dung dịch ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.7 Canh thang D-tartrat (axit tartrat hữu cơ)

...

...

...

Pepton^a

10,0 g

Kali natri (+) tartrat

10,0 g

Dung dịch bromothymol xanh, 10 g/l

2,4 ml

Nước

1 000 ml

^a Ví dụ: phân giải casein bằng enzym.

...

...

...

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ống có dung tích danh định 15 ml.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 115 °C trong 10 min.

Bảo quản ở nơi tối ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.8  Dung dịch chì axetat

A.8.1  Thành phần

Chì axetat

khoảng 50 g

...

...

...

10 ml

A.8.2  Chuẩn bị

Cho nước vào chai có nắp vặn thích hợp. Bổ sung đủ lượng chì axetat để tạo dung dịch bảo hòa (nghĩa là có thấy chì axetat không tan rõ trên đáy chai).

Bảo quản ở nhiệt độ phòng đến 6 tháng.

A.9  Canh thang tim-não (BHI)

A.9.1  Thành phần

Bột não

12,5 g

Bột tim bò

...

...

...

Pepton proteose

10,0 g

Glucose

2,0 g

Natri clurua

5,0 g

Dinatri phosphat

2,5 g

Nước

...

...

...

A.9.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng, nếu cần.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,4 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ống có dung tích danh nghĩa 15 ml.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 121 °C trong 15 min.

Bảo quản nơi tối ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

A.10  Dung dịch nước muối formal (1 % phần thể tích)

A.10.1  Thành phần

Dung dịch formaldehyd, 370 g/l

...

...

...

Dung dịch natri clurua 170 g/l

200 ml

Nước

Lên đến 4 000 ml

A.10.2  Chuẩn bị

Cho dung dịch formaldehyd vào dung dịch natri clurua. Thêm nước đến tổng thể tích 4 I.

A.11  ỐNG Craigie

A.11.1  Thành phần

Canh thang dinh dưỡng^a

...

...

...

Thạch

2,75 g

Nước

1 000 ml

^a Đối với các thành phần, xem A.2 (không có thạch).

A.11.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng là 7,2 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi trường nuôi cấy với các lượng 5 ml vào các ống hoặc chai miệng rộng có nắp vặn có dung tích danh nghĩa khoảng 15 ml và chứa các ống Craigie (các ống hẹp ngắn, mở ở cả hai đầu). Ống Craigie cần cao hơn bề mặt thạch.

...

...

...

Bảo quản ở nhiệt độ phòng đến 2 tháng.

A.12  Gelatin dinh dưỡng

A.12.1  Thành phần

Chất chiết từ thịt

3,0 g

Pepton^a

5,0 g

Gelatin

120,0 g

...

...

...

1 000 ml

^a Ví dụ: phân giải casein bằng enzym.

A.12.2  Chuẩn bị

Hòa tan các thành phần trong nước bằng cách đun nóng.

Chỉnh pH để sau khi khử trùng pH tương ứng tà 6,8 ± 0,2 ở 25 °C, nếu cần.

Chuyển môi nuôi cấy trường với các lượng 5 ml vào các ống có dung tích danh nghĩa 15 ml.

Khử trùng trong nồi hấp áp lực (6.2) được duy trì ở 121 °C trong 15 min.

Để môi trường nguội theo vị trí thẳng đứng và bảo quản ở 5 °C (6.3) đến 2 tháng.

...

...

...

(Tham khảo)

Ví dụ về các quy trình xác định typ huyết thanh của chủng phân lập Salmonella chưa biết

Trong Hình B.1 chỉ ra các bước cần thực hiện trước khi xác định typ huyết thanh các chủng phân lập Salmonella. Đưa ra các đề xuất về cách xử lý với các chủng tự ngưng kết (chủng thô), xem 9.2.3.

Các ví dụ về quy trình có thể được sử dụng để xác định typ huyết thanh chủng phân lập Salmonella chưa biết được tóm tắt trong Bảng B.1 và Hình B.2. Trong Bảng B.2 đưa ra thông tin về thành phần của các kháng huyết thanh đa giá (có thể khác nhau giữa các nhà cung cấp). Hình B.2 và Bảng B.2 thu được từ Tài liệu tham khảo [6].

Hình B.1 - Các bước cần thực hiện trước khi xác định typ huyết thanh Salmonella spp.

Bảng B.1 - Quy trình xác định typ huyết thanh chủng phân lập Salmonella chưa biết bằng cách ngưng kết với các kháng huyết thanh OMA và OMB đa giá

Bước 1

Phân tích kháng nguyên-O

...

...

...

1.1             OMA

Nếu dương tính: bước 2.1.1

Nếu âm tính: sang bước 1.2

1.2                OMB

Nếu dương tính: bước 2.2.1

Nếu âm tính: xem chú thích a

Bước 2

Phân tích kháng nguyên-O

Sử dụng các nhóm kháng huyết thanh đặc hiệu - dùng cho một chủng phân lập đối với nhóm huyết thanh^b

...

...

...

Nếu dương tính: bước 3.1.1

Nếu âm tính: bước 2.1.2

2.1.2     O:9 hoặc nhóm D

Nếu dương tính: bước 3.1.2

Nếu âm tính: bước 2.1.3

2.1.3    O:3,10,15 hoặc nhóm E

Nếu dương tính: bước 3.1.3

Nếu âm tính: bước 2.1.4

2.1.4       O:21 hoặc nhóm L

...

...

...

2.1.5     O:1,2 hoặc nhóm A

2.2.1   O:6,7,8 hoặc nhóm C

Nếu dương tính: bước 3.2.1

Nếu âm tính: bước 2.2.2

2.2.2  O:13.22,23 hoặc O:13

Nếu dương tính: bước 3.2.2

Nếu âm tính: bước 2.2.3

2.2.3               O:11

Bước 3

...

...

...

Sử dụng các kháng huyết thanh đơn giá - nhận biết serovar kháng nguyên-O đặc hiệu

3.1.1   Chủng phân lập nhóm B:

O:5, O:27

3.1.2   Chủng phân lập nhóm D:

O:46 đối với nhóm D₂

O:27 đối với nhóm D₃

3.1.3 Chủng phân lập nhóm E:

O:10,O:15,O:34 đối với nhóm E₁

O:19 đối với nhóm E₄

...

...

...

O:7 đối với nhóm C₁

O:8, O:6₁, O:20 đối với nhóm C_2-3

O:14, O:24, O:25 đối với nhóm H

3.2.2  Chủng phân lập nhóm G

O:22, O:23

Bước 4

Phân tích kháng nguyên lông

Sử dụng các kháng huyết thanh đa giá

H đa giá (pha 1 và pha 2)

...

...

...

Sử dụng các kháng huyết thanh đơn giá

H:1(1,2) → (H:2, H:5, H:6, H:7)^d

H:a, H:b, H:c, H:d,

H:E→(H:h, H:n, H:x, Hz₁₅)^d

H:G(g.m) → (H:f, H:g, H:m; H:p, H:q H:s, H:t, H:u]^d

H:i, H:k.

H:L→(H:v, H:w, H:l,z₁₃, H:l,z₂₈)^d

H:y H:z,

H:Z₄→ (H:z₂₃, H:z₂₄, H:z₃₂)d

...

...

...

^a Trong trường hợp phản ứng âm tính với cả hai kháng huyết thanh đa giá thì thử phân lập tiếp với kháng huyết thanh đa giá hoặc nhóm kháng huyết thanh đặc hiệu cho phép nhận biết lên đến nhóm O:67 hoặc gửi chủng phân lập đến phòng thử nghiệm chuẩn.

^b Nếu trong Bước 1 kháng huyết thanh đa giá của kháng thể khác với OMA và OMB được sử dụng thi kháng huyết thanh nhóm đặc hiệu trong bước 2 phải được sửa lại tương ứng.

^c Có thể bỏ qua việc sử dụng kháng huyết thanh đa giá kháng H và chọn kháng huyết thanh đơn giá tương ứng với bằng chứng phân lập serovar của nhóm huyết thanh được ước tính.

^d Kháng huyết thanh trong ngoặc đơn cần thiết để nhận biết các kháng nguyên của phức hợp kháng nguyên H tương ứng.

* Có thể sử dụng huyết thanh O:1,2 để kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên O:1

a) Các kháng nguyên thân - Các phép thử tuần tự có thể tiến hành với các kháng huyết thanh đơn giá và đa giá để phát hiện kháng nguyên Salmonella thân (Tài liệu tham khảo [6]) [Bước tiếp theo trong dãy hàng ngang được thực hiện khi các thử nghiệm trước đó cho thấy có phản ứng dương tính (ví dụ: nếu O:4,5 là dương tính, thì tiếp theo kiểm tra đối với O:5, v.v...). Thành phần của các kháng huyết thanh đa giá được sử dụng trong sơ đồ được đưa ra trong Bảng B.2.]

...

...

...

b) Kháng nguyên lông - Các phép thử tuần tự có thể tiến hành với các kháng huyết thanh đơn giá và đa giá để phát hiện các kháng nguyên Salmonella lông (Tài liệu tham khảo [6]) [Bước tiếp theo trong đường ngang được thực hiện khi các thử nghiệm trước đó cho thấy có phản ứng dương tính. Thành phần của các kháng nguyên đa giá được sử dụng trong sơ đồ này được nêu trong Bảng B.2.]

Hình B.2 - Phát hiện kháng nguyên

Bảng B.2 - Thành phần của các kháng huyết thanh đa giá liên quan đến Hình B.2 (Tài liệu tham khảo [6])

Yếu tố

Kháng huyết thanh đa giá

Kháng nguyên tương ứng

O

OMA

1,2,12 + 4,5,12 + 9,12 + 9,46 + 3,10 + 3,15 + 1,3,19 + 21

...

...

...

6,7 + 6,8+ 11 + 13,22+ 13,23 + 6,14,24 + 8,20

H

H1

1,2 + 1,5 + 1,6 + 1,7 + z₆

HE

e,h + e,n,x + e,n,z₁₅

HG

f,g + g,p + g,m,s + g,m + m,t

HMA

...

...

...

HMB

e,h + e,n,x + e,n,z₁₅ + G

HMC

k + y + L + z₄ + r

Phụ lục C

(Tham khảo)

Phép thử sinh hóa

C.1  Phân biệt các phân loài Salmonella

...

...

...

Để phân biệt các phân loài Salmonella, cần thực hiện một số phép thử sinh hóa (xem bảng 2). Một số ví dụ về các phép thử được đưa ra trong C.1.2 đến C.1.5.

C.1.2  Phép thử malonat

Cấy vào canh thang malonat (xem A.4) dịch cấy thu được từ thạch nghiêng hoặc từ canh thang mới cấy (tốt nhất là cấy một vòng cấy 3 mm đầy canh khuẩn).

Ủ ấm canh thang đã cấy trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) và quan sát phản ứng sau 24 h ± 3 h và sau 48 h ± 3 h.

Trong trường hợp có phản ứng dương tính, màu sắc của môi trường thay đổi từ màu xanh lá cây sang màu xanh chàm (Prussian blue).

C.1.3  Phép thử dulcitol

Cấy vào canh thang dulcitol (xem A.5) với 1 ml canh khuẩn hoặc từ môi trường thạch nghiêng mới.

Ủ canh thang đã cấy trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) và quan sát các phản ứng sau 24 h ± 3 h và sau 48 h ± 3 h.

Trong trường hợp có phản ứng dương tính (axit hóa), thì môi trường sẽ chuyển sang màu hồng.

...

...

...

Nuôi cấy chủng phân lập cần thử nghiệm trên thạch dinh dưỡng nghiêng (hoặc môi trường khác) (xem A.2) có chứa 1,0 % khối lượng lactose. Nhũ hóa mọt vòng cấy đầy sinh khối vi khuẩn vào 0,25 ml dung dịch nước muối sinh lý để thu được huyền phù “đặc”. Thêm 1 giọt toluen vào mỗi ống và lắc đều để giải phóng enzym.

Để các ống ở nhiệt độ trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 5 min.

Thêm 0,25 mol dung dịch ONPG 0,013 3 mol/l (A.6) vào mỗi ống dung dịch huyền phù cần thử nghiệm. Ủ các ống trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) và kiểm tra các ống ở các khoảng thời gian đến 24 h. Màu vàng chứng tỏ kết quả dương tính.

C.1.5  Phép thử gelatinase

Cấy đâm sâu chất cấy thu được từ chủng cấy thuần được ủ “qua đêm” vào môi trường gelatin dinh dưỡng (xem A.12).

Ủ các ống trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 24 h ± 3 h.

Đặt ống trong nước đá hoặc để trong tủ lạnh khoảng 30 min. Nếu gelatin bị phân giải, thì môi trường trong ống đông đặc sau khi làm lạnh, điều này cho thấy sự có mặt của gelatinase.

Ngoài ra, ống có thể được ủ ở 25 °C đến 1 tuần, kiểm tra hàng ngày về sự hóa lỏng của gelatin. Vì gelatin có thể hóa lỏng ở nhiệt độ 28 °C, nên cần làm mát các ống đã ủ để đảm bảo rằng việc hóa lỏng là do gelatinase và không phải do nhiệt độ ủ. Điều này có thể hữu ích cho việc sử dụng một ống không nuôi cấy làm kiểm chứng.

C. 2  Phân biệt giữa Salmonella Paratyphi B và Salmonella Paratyphi B typ sinh học Java

...

...

...

Đối với phản ứng D-tartrat, có thể thực hiện quy trình sau đây (Tài liệu tham khảo [1]).

- Nuôi cấy chủng cần thử nghiệm trên môi trường thạch không chọn lọc.

- Hòa khuẩn lạc trong dung dịch nước muối 8,5 g/l đến mật độ khoảng 10⁹ cfu/ml.

- Cấy các phần 50 µl của từng chủng vào hai ống chứa canh thang D-tartrat (xem A.6). Cũng cấy hai chủng kiểm chứng vào hai ống canh thang D-tartrat. Phép kiểm chứng: dương tính là Salmonella Paratyphi B typ sinh học Java, âm tính là Salmonella Paratyphi B.

- Ủ các ống hiếu khí (không lắc) trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 18 h ± 2 h.

- Sau khi ủ, kiểm tra các ống về sự đổi màu. Nếu môi trường chuyển từ màu xanh sang màu vàng thì chứng tỏ phản ứng dương tính.

- Thêm vào một dãy các ống đựng canh thang mỗi ống 0,5 ml dung dịch chì axetat bão hòa (xem A.8) và để yên các ống tối thiểu 30 min để cho kết tủa lắng xuống.

- Sau đó, kiểm tra các ống về kết tủa (thường sau 1 h đến 2 h). Trường hợp phản ứng dương tính thì có kết tủa lắng ở đáy ống và trường hợp phản ứng âm tính thì kết tủa vẫn còn lơ lửng trong môi trường canh thang. Các ống nghiệm này được so sánh với các ống kiểm chứng dương tính và âm tính. Nếu phép thử dương tính thì chủng được coi là Salmonella Paratyphi B typ sinh học Java và ống D-tartrat thứ hai được loại bỏ.

- Nếu phép thử âm tính thì ống thứ hai và các ống kiểm chứng được ủ thêm 6 ngày (tổng thời gian ủ là 7 ngày).

...

...

...

- Các chủng dương tính sau 7 ngày được coi là Salmonella Paralyphi B typ sinh học Java và chủng âm tính được coi là Salmonella Paratyphi B.

Phụ lục D

(tham khảo)

Sơ đồ tổng thể về xác định typ huyết thanh của năm sarovar Salmonella có ảnh hưởng lớn đến sức khỏe cộng đồng

0:4

0:9

0:7

0:7

...

...

...

↓

↓

↓

↓

↓

+

+

+

+

...

...

...

↓

↓

↓

↓

↓

(O:5→ + hoặc -)

H:G hoặc H:g

H:r

H:r

...

...

...

│

↓

↓

↓

↓

↓

+

+

+

...

...

...

H:i

↓

↓

↓

↓

...

...

...

H:m

H:2

H:2

H:x

+

...

...

...

↓

↓

↓

↓

↓

H:2

+

+

-

...

...

...

↓

↓

↓

↓

↓

+

H:q, H:s

H:5

H:5

...

...

...

↓

↓

↓

↓

↓

│

-

-

+

...

...

...

│

↓

│

│

│

│

0:46

│

│

...

...

...

│

↓

│

│

│

│

-

│

│

...

...

...

↓

↓

↓

↓

↓

...

...

...

Salmonella ser. Typhimurium

Salmonella ser. Enteritidis

Salmonella ser. Virchow

Salmonella ser. Infantis

Salmonella ser. Hadar

Phụ lục E

(Tham khảo)

Phương pháp đĩa chuẩn độ vi giếng để xác định typ huyết thanh Salmonella spp.

...

...

...

Quy trình nêu trong phụ lục này được dựa trên Tài liệu tham khảo [21].

Trong các phòng thử nghiệm việc xác định typ huyết thanh với số lượng lớn các chủng Salmonella, sử dụng kỹ thuật đĩa chuẩn độ vi giếng kết hợp với hệ thống phân phối kháng huyết thanh bán tự động vào các đĩa có thể có nhiều ưu điểm.

Tổng quan về các phương pháp:

- Các huyền phù vi khuẩn được chuẩn bị để phát hiện các kháng nguyên O (huyền phù-O) và các kháng nguyên-H (huyền phù H). Huyền phù vi khuẩn được chuẩn bị bằng cách nuôi cấy từng chủng cần thử nghiệm trong hai canh thang não-tim (xem A.9): một trong chai đối với huyền phù O và một trong ống nghiệm đối với huyền phù H. Cả hai canh thang được ủ ở nhiệt độ trong khoảng từ 34 °C đến 38 °C (6.1) trong 4 h đến 5 h.

- Sau khi ủ, các huyền phù O được hấp bằng hơi nước trong 30 min và sau đó pha loãng với một lượng tương đương dung dịch nước muối 8,5 g/l.

- Sau khi ủ, các huyền phù H bị diệt bằng cách thêm một lượng tương đương dung dịch nước muối formal 1 % (xem A.10) và để yên ở nhiệt độ phòng qua đêm trước khi thử nghiệm.

- Kháng huyết thanh được phân phối vào đĩa 96 giếng đáy tròn, sử dụng pipet đa kênh hoặc hệ thống phân phối tự động. Các đĩa đã chuẩn bị có thể được gắn kín và bảo quản ở 5 °C (6.3) tối đa 2 tuần.

- Các huyền phù O và H đã chuẩn bị được phân phối thủ công vào các đĩa vi giếng đã được chuẩn bị, sử dụng pipet bằng chất dẻo dùng một lần hoặc pipet có đầu tip dùng một lần.

- Các đĩa ngưng kết O được gắn kín và ủ ở 50 °C (6.9) trong 18 h ± 3 h.

...

...

...

- Sau khi ủ, kiểm tra ngưng kết. Quan sát sự ngưng kết lắng dưới đáy giếng và tốt nhất là quan sát từ phía dưới đĩa, sử dụng gương.

Trước khi sử dụng; xác định độ chuẩn của các kháng huyết thanh cần thử nghiệm trong các đĩa vi giếng.

Các kháng huyết thanh dự định sử dụng trong phương pháp đĩa vi giếng là 23 kháng huyết thanh-O được sắp xếp trong hai đĩa vi giếng có kiểm soát dung dịch muối trong đĩa thứ hai. Đĩa đầu tiên chứa kháng huyết thanh-O đa giá (PSO), bảy kháng huyết thanh đối với các nhóm 4,5,12; 6,7; 6,8; 9,12; 3,10; 13,22; 6,14,24 và bốn kháng huyết thanh hấp thụ 1, 20, 27 và 46. Các đĩa thứ hai chứa các kháng huyết thanh hấp thụ 4, 5, 7,8,9,10,14,15,19, 22 và 23.

E.2  Đĩa vi giếng 1 đối với các kháng nguyên O

Cột của đĩa

1

2

3

4

...

...

...

6

7

8

9

10

11

12

Huyết thanh trong từng giếng của cột

PSO

...

...

...

6,7

6,8

9,12

3,10

13,22

6,14,24

1

20

27

...

...

...

E.3  Đĩa vi giếng 2 đối với các kháng nguyên O

Cột của đĩa

1

2

3

4

5

6

7

...

...

...

9

10

11

12

Huyết thanh trong từng giếng của cột

4

5

7

8

...

...

...

10

14

15

19

22

23

Kiểm chứng

Mỗi chủng được thử nghiệm đối với tất cả các huyết thanh trong đĩa vi giếng. Tám chủng có thể được thử nghiệm trong mỗi bộ hai đĩa vi giếng.

Để xác định kháng nguyên-H, mỗi chủng được thử nghiệm với một bộ gồm 11 kháng huyết thanh và nước muối kiểm chứng. Các kháng huyết thanh được gợi ý là Salmonella H đa giá (PSH 1+2) có chứa kháng thể H = a cho đến H = z₂₉ để bao trùm pha 1 và kháng thể đối với pha 2 phức H = 1,2,5,6,7 (PSH 2). Bốn kháng huyết thanh đối với các phức H = E;G;L;1,2,5,6,7 và sáu kháng huyết thanh hấp thụ đối với H = b,d,i,r,z,z₁₀

...

...

...

Cột của đĩa

1

2

3

4

5

6

7

8

...

...

...

10

11

12

Huyết thanh trong từng giếng của cột

PSH 1+2

E

G

L

PSH2

...

...

...

d

i

r

z

z₁₀

Kiểm chứng

Việc nhận biết pha 1 là hoàn chỉnh đối với các chủng ngưng kết với PSH 1+2 và một trong sáu kháng huyết thanh hấp thụ và không cần tiếp tục thử đối với pha 1. Đối với các chủng ngưng kết với PSH và một trong bốn phức, thì cần thử nghiệm tiếp để nhận biết các kháng nguyên đơn giá. Các chủng chỉ ngưng kết với PSH được thử nghiệm với các kháng huyết thanh H = a,c,k,y,z₄ và z₂₉.

Sau khi đảo pha, cần lặp lại quy trình thử kháng nguyên-H để xác định các Kháng nguyên của pha khác.

...

...

...

(Tham khảo)

Ví dụ về các quy trình đảo pha

F.1  Phương pháp Sven Gard rút gọn

Phương pháp này được trích dẫn từ Tài liệu tham khảo [8], [13].

Chuẩn bị đĩa Petri đường kính 55 mm (6.7) với 10 ml thạch di động bồ mặt đã đông đặc (A.3). Thêm 0,1 ml kháng Salmonella H từng giọt một và dàn đều trên bề mặt, sử dụng một thìa vô trùng (thủy tinh). Cấy chủng tại một điểm duy nhất ở giữa đĩa.

Ủ đĩa đã cấy ở 34 °C đến 38 °C (6.1) từ 18 h đến 21 h. Chủng di động trên bề mặt không bị ức chế pha H sử dụng để xác định lần thứ hai.

Phương pháp rút gọn này thường cho phép nhận biết pha thứ hai ở lần thử đầu tiên. Phương pháp này có ưu thế là các đĩa thạch được chuẩn bị trước và được bảo quản để sử dụng khi cần nhằm cải thiện sự biểu hiện của kháng nguyên-H hoặc để xác định pha.

F.2  Phương pháp ống Craigie

F.2.1  Yêu cầu chung

...

...

...

F.2.2  Chuẩn bị ống Craigie cho đảo pha

- Đặt ống môi trường Craigie (xem A.11) vào trong nồi hấp (hoặc các thiết bị thích hợp khác) trong 30 min để làm tan chảy thạch.

- Đặt ống Craigie với thạch đã tan chảy vào trong nồi cách thủy ở 47 °C đến 50 °C (6.8) để cho cân bằng nhiệt.

- Thêm 200 ml kháng huyết thanh cần thiết vào ống Craigie.

- Trộn đều bằng cách lắc nhẹ.

- Đặt ống Craigie ở 5 °C (6.3) để cho đặc lại.

F.2.3  Quy trình đảo pha sử dụng ống Craigie

- Cấy Salmonella vào ống Craigie bằng que cấy nhựa dùng một lần hoặc que cấy thẳng (chủng cấy được cấy vào trong ống bên trong).

- Ủ ống Craigie ở nhiệt độ trong khoảng từ 34 °C đến 30 °C (6.1).

...

...

...

- Khi xuất hiện vi khuẩn trên bề mặt thạch (bên ngoài ống trung tâm), gạt phần vi khuẩn phát triển vào canh thang não-tim (xem A.9).

- Sau đó canh khuẩn được đêm thử về kháng nguyên-H của nó.

CHÚ DẪN

1  nắp

5  đường đi của Salmonella sau đảo pha

2  miệng ống

6  bề mặt được cấy truyền

3  điểm cấy

...

...

...

4  môi trường bán đặc

Hình F.1 - Phương pháp ống Craigie

F.3  Phương pháp cầu-giấy

Quy trình nêu trong điều này được lấy từ Tài liệu tham khảo [4], là quy trình được sửa đổi từ quy trình ban đầu nêu trong Tài liệu tham khảo [23].

Xem Hình F.2. Lấy một dải thạch trypton đậu tương (rộng 1 cm) để tạo thành rãnh đi qua tâm của đĩa. Các dài giấy lọc (3 mm x 3 cm) được bố trí trên rãnh này. Kháng huyết thanh dựa theo pha nhận biết được chấm vào giữa cầu-giấy (được nhận biết bằng các vòng tròn màu trắng). Các chủng vi khuẩn được cấy vào phần cuối bên trái của các dải (được nhận biết bằng các vòng tròn màu trắng). Sau khi ủ, các pha biến thể, thể hiện một kháng nguyên lông khác, di chuyển về phía cuối bên phải của dải. Sau khi ủ 16 h, có thể nhìn thấy sự phát triển vi khuẩn xung quanh viền giấy lọc (thể hiện bằng các điểm tam giác màu trắng). Các chủng được cấy trong đĩa ở Hình F.2 là (A) S. Choleraesuis var. Kunzendorf (6,7:c:-); (B) S. Typhimurium (1,4,5,12:i:1,2); và (C) S. Stanley (4,5,12:d:1;2)

Hình F.2 - Phương pháp cầu-giấy đối với đảo pha Salmonella

...

...

...

[1] ALFREDSSON G.A., BARKER R.M., OLD D.C., DUGUID J.p. Use of tartaric acid isomers and citric acid in the biotyping of Salmonella typhimurium. J. Hyg. (Lond). 1972, 70 pp. 651-666

[2] US Food and Drug officials. 2001.BacteriologicalAnalyticalManual.BAMR53:ONPGtest. Available (viewed 2013-06-04] at: http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm062262.htm

[3] BRENNER F.W., VlLLAR R.G., ANGULO F.J., TAUXE R., SWAMINATHAN B. Salmonella nomenclature. J. Clin. Microbiol. 2000, 38 pp. 2465-2467

[4] CHIOU C.S., HUANG J.F., TSAI L.H., Hsu K.M., LIAO C.S., CHANG H.L. A simple and low-cost paper- bridged method for Salmonella phase reversal. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2006, 54 pp. 315-317

[5] Craigie J. STUDIES ON THE SEROLOGICAL REACTIONS OF FLAGELLA OF B. TYPHOSUS. J. IMMUN. 1931, 21 p. 417

[6] DANAN C., FREMY S., MOURY F., BOHNERT M., BRISABOIS A. 2009. Determining the serotype of isolated Salmonella strains in the veterinary sector using the rapid slide agglutination test. Cahiers de la Référence, N°.2, CR2-09M01, December 2009. Available (viewed 2013-06-04] at: http://www.afssa.fr/euroreference/numero2/index.htm

[7] EWING W.H. Edwards and Ewing's identification of Enterobacteriaceae. New York:Elsevier, Fourth edition, 1986

[8] GARD s. Das Schwarmphanomen in der Salmonella-Gruppe und seine praktische Ausniitzung. [The swarming phenomenon in the Salmonella group and its practical use], z. Hyg. Infektionskr. 1938,120 pp. 615-619.

[9] GRIMONT P.A.D., & WEILL F.-X. 2007. Antigenic formulae of the Salmonella serovars, 9th edition1). WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Paris:lnstitut Pasteur. Available (viewed 2013-06-04] at:http://www. pasteur.fr/ip/portal/action/ WebdriveActionEvent/oid/01s-000036-089.

...

...

...

[11] HENDRIKSEN R.S., MlKOLEIT M., CARLSON V.P., KARLSMOSH s., VlEIRA A.R., [ENSEN A.B., et al. WHO Global Salm-Surv Exlernal Quality Assurance System for Xác định typ huyết thanh of Salmonella- Isolates from 2000 to 2007. J. Clin. Microbiol. 2009, 47 pp. 2729-2736

[12] KAUFFMANN F. On the principles of classification and nomenclature of Enterobacteriaceae. Int. Bull. Bacteriol. Nomencl. Taxon. 1959, 9 pp. 1-6

[13] KOEHN A; Technical modification of the swarming plate method according to Sven Gard in Salmonella diagnosis. Zentralbl. Bakteriol. 1970, 215 pp. 449-455

[14] LEIFSON E. Fermentation of natri malonate as a means of differentiating Aerobacter and Escherichia coli. ]. Bacteriol. 1933, 26 pp. 329-330

[15] MALORNY B., BUNGE C., HELMUTH R. Discrimination of D-tartrate-fermenting and non-fermenting Salmonella entérica subsp. entérica isolates by genotypic and phenotypic methods. J. Clin. Microbiol. 2003, 41 pp. 4292-4297

[16] POPOFF M. Y. Guidelines for the preparation of Salmonella antisera. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella. Paris:lnstitut Pasteur, 2001

[17] POPOFF M.Y., & LE MINOR L.E. Genus XXXIII. Salmonella Lignieres 1900, 389. InBRENNER D. J., KRIEG N.R., STALEY J.T. editors. Bergey's manual of systematic bacteriology, 2nd edition, Vol. 2. The Proteobacteria, Part B The Gammaproteobacteria. New York, NY:Springer, 2005, pp. 764-799

[18] POPOFF M.Y., BOCKEMUHL J., BRENNER F.W. Supplement 1998 (No. 42] to the Kauffmann- White scheme. Res. Microbiol. 2000, 154 pp. 63-65

[19] POPOFF M.Y., BOCKEMUHL J., GHEESLING L.L. Supplement 2001 (No. 45] to the Kauffmann- White scheme. Res. Microbiol. 2003, 151 pp. 173-174

...

...

...

[21] SHIPP C.R., & ROWE B. A mechanized microtechnique for Salmonella serotyping. J. Clin. Pathol. 1980, 33 pp. 595-597

[22] TINDALL B.J., GRIMONT P.A.D., GARRITY G.M., EUZEBY J.P. Nomenclature and taxonomy of the genus Salmonella. Int.J.Syst.Evol. Microbiol. 2005, 55 pp. 521-524

[23] Wang T.K., TSENG T.C., LEE J.H., Wang W.T., TSAI J.L., Ho S.I., Pan T.M. Analysis of Salmonella serovars in Taiwan by the phase induction method] [Article in Chinese]. Zhanghua Min Guo Wei Shang Wu Ji Mian YiXue Za Zhi [Chin. J. Microbiol. Immunol.]. 1994, 27, pp. 13-24

1) Supplements to the White-Kauffmann-Le Minor scheme are published in Res. Microbiol., a publication of the Institut Pasteur (formerly Ann. Inst. Pasteur/Microbiol), e.g. Reference [10].

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10780-3:2016 (ISO/TR 6579-3:2014) về Vi sinh vật trong chuỗi thực phẩm - Phương pháp phát hiện, định lượng và xác định typ huyết thanh của Salmonella - Phần 3: Hướng dẫn xác định typ huyết thanh của Salmonella spp