4. Nguyên tắc và phản ứng

4.1. Nguyên tắc

D-glucose và D-fructose có trong mẫu thử pha loãng được phosphorin hóa tại vị trí cacbon số 6 (C-6) trong phản ứng xúc tác enzym bao gồm ATP và HK.

Trong phản ứng trùng hợp, glucose 6-phosphat được chuyển thành 6-phosphogluconat khi có mặt NADP, phản ứng được xúc tác bởi enzym G-6-P-DH và một lượng NADPH tương đương với lượng D-glucose được tạo thành (4.2) có mặt trong mẫu thử.

Hàm lượng D-fructose có thể xác định được bằng cách cho phản ứng tiếp trong đó PGI xúc tác đồng phân hóa F-6-P thành G-6-P (4.3).

Định lượng NAPDH tạo thành và hàm lượng D-glucose và/hoặc D-fructose bằng đo phổ.

4.2. Phản ứng trong phép xác định D-glucose

D-glucose + ATP  G-6-P + ADP

G-6-P + NADP⁺  6-phosphogluconat + NADPH + H⁺

...

...

...

D-fructose + ATP  F-6-P + ADP

F-6-P  G-6-P

G-6-P + NADP⁺  6-phosphogluconat + NADPH + H⁺

5. Thuốc thử

5.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước đạt loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).

5.2. Dung dịch đệm triethanolamin, pH = 7,6

Hòa tan 14,0 g triethanolamin clohydric và 0,25 g magie sulfat ngậm bảy phân tử nước (MgSO₄.7H₂O) trong 80 ml nước, điều chỉnh đến pH 7,6 dùng khoảng 5 ml dung dịch natri hydroxit, c(NaOH) = 5 mol/l và thêm nước đến 100 ml. Khi được bảo quản ở 4 °C dung dịch này bền được ít nhất 4 tuần.

5.3. Dung dịch NADP

...

...

...

5.4. Dung dịch ATP

Hòa tan 300 mg muối dinatri adenosin-5'-triphosphat ngậm ba phân tử nước (ATP-Na₂H₂.3H₂O) và 300 mg natri hydro cacbonat (NaHCO₃) trong 6 ml nước. Khi được bảo quản ở 4 °C dung dịch này bền được ít nhất 4 tuần.

5.5. Huyền phù enzym HK/G6P- DH

Tạo huyền phù hexokinase, r(HK) = 2 mg/ml, khoảng 280 IU/ml (D-glucose làm cơ chất với sự có mặt của ATP) và glucose-6-phosphat-dehydrogenase r(G6P-DH) = 1 mg/ml, khoảng 140 IU/ml với glucose 6-phosphat làm cơ chất trong dung dịch amoni sulfat, c[(NH₄)₂SO₄] = 3,2 mol/l. Khi được bảo quản ở 4 °C dung dịch huyền phù này bền được ít nhất một năm.

5.6. Huyền phù enzym PGI

Tạo huyền phù phosphoglucose isomerase, r(PGI) = 2 mg/ml, khoảng 700 IU/ml (với fructose 6-phosphat làm cơ chất) trong dung dịch amoni sulfat, c[(NH₄)₂SO₄] = 3,2 mol/l. Khi được bảo quản ở 4 °C dung dịch huyền phù này bền được ít nhất một năm.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

6.1. Pipet dùng cho enzym, chia vạch dọc theo thân, có đầu phân phối dài không chia vạch.

...

...

...

6.3. Cuvet, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, chiều dài đường quang 10 mm và hấp thụ không đáng kể ở bước sóng 334 nm, 340 nm và 365 nm.

6.4. Máy đo phổ vạch, có đèn thủy ngân và bộ lọc để đo ở bước sóng 334 nm hoặc 365 nm.

6.5. Máy đo phổ, (bước sóng có thể thay đổi được) để đo ở bước sóng 340 nm (có thể dùng thay thế 6.4).

7. Cách tiến hành

7.1. Chuẩn bị mẫu thử

Thông thường các mẫu không cần xử lý trước và phép phân tích theo phương pháp này nên dựa vào thể tích, các kết quả được biểu thị trên 1 lít mẫu. Đối với các mẫu cô đặc, có thể cũng tiến hành phân tích dựa vào thể tích, sau khi pha loãng đến tỷ trọng tương đối đã biết. Trong trường hợp này, tỷ trọng tương đối phải được nêu rõ. Dựa vào lượng mẫu đã cân và hệ số pha loãng, các kết quả có thể được biểu thị trên 1 kg mẫu. Đối với các sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc có chứa lượng thịt quả rất cao thì thường tiến hành phép xác định theo khối lượng mẫu thử.

Trộn kỹ nước quả đục. Pha loãng mẫu thử sao cho nồng độ D-glucose hoặc D-glucose + D-fructose trong khoảng từ 0,1 g/l đến 1,0 g/l. Dung dịch này được dùng để xác định kể cả khi dung dịch có màu đậm.

7.2. Qui trình thử nghiệm

7.2.1. Yêu cầu chung

...

...

...

NADPH hấp thụ tối đa ở bước sóng 340 nm. Khi sử dụng máy đo phổ có bước sóng thay đổi thì chỉ đo ở độ hấp thụ tối đa. Khi sử dụng đèn hơi thủy ngân thì sử dụng máy đo dải phổ để đo ở bước sóng 334 nm hoặc 365 nm.

Không dùng pipet một vạch để lấy các dung dịch. Các dung dịch enzym, coenzym và dung dịch đệm có thể được bổ sung từ pipet tự động thích hợp. Dùng pipet dùng cho enzym (6.1) hoặc loại tương đương (6.2) để lấy dung dịch mẫu.

Phép xác định này cũng có thể được tiến hành sử dụng bộ kít thử kết hợp có bán sẵn trên thị trường.

Nếu chất cần được xác định có bán sẵn ở dạng tinh khiết phù hợp, thì nên dùng chất này làm dung dịch chuẩn.

7.2.2. Dung dịch mẫu trắng

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.2), 0,10 ml dung dịch NADP (5.3), 0,10 ml dung dịch ATP (5.4), và 2,00 ml nước cho vào cuvet. Trộn đều và sau khoảng 3 min, đọc độ hấp thụ (A₁) của dung dịch so với không khí (không có cuvet trong đường quang).

7.2.3. Dung dịch mẫu thử

Dùng pipet lấy 1,00 ml dung dịch đệm (5.2), 0,10 ml dung dịch NADP (5.3), 0,10 ml dung dịch ATP (5.4), 0,10 ml mẫu thử và 1,90 ml nước cho vào cuvet. Trộn đều và sau khoảng 3 min, đọc độ hấp thụ (A₁) của dung dịch so với không khí (không có cuvet trong đường quang).

7.2.4. Phản ứng enzym và định lượng

...

...

...

Sau đó, thêm 0,02 ml huyền phù enzym (PGI) (5.6). Trộn đều, đợi cho đến khi phản ứng kết thúc (10 min đến 15 min) và đọc độ hấp thụ (A3) của các dung dịch. Kiểm tra việc kết thúc phản ứng bằng cách cứ 2 min đọc độ hấp thụ A₃ một lần. Nếu phản ứng chưa kết thúc sau 15 min và độ hấp thụ vẫn tăng đều, thì ngoại suy độ hấp thụ ngược trở lại thời điểm bổ sung huyền phù enzym (PGI) (5.6).

8. Tính kết quả

Dựa vào các phản ứng, thực hiện phép xác định, có sự tỷ lệ tuyến tính giữa lượng NADPH tạo thành (do chênh lệch độ hấp thụ ΔA) và nồng độ của D-glucose và D-fructose.

ΔA_D-glucose = (A₂ - A₁)_mẫu - (A₂ - A₁)_{mẫu trắng}

ΔA_D-fructose = (A₃ - A₂)_mẫu - (A₃ - A₂)_{mẫu trắng}

Việc tính nồng độ chất trong dung dịch pha loãng bằng phương pháp hấp thụ nguyên tử dựa theo định luật Beer-Lambert.

Hàm lượng D-glucose và/hoặc D-fructose, tính bằng gam trên lit mẫu, tính được theo Công thức sau:

M x V₁ x F

x DA

...

...

...

Trong đó:

M là khối lượng phân tử glucose hoặc fructose = 180,16 gam trên mol (g/mol);

V₁ là tổng thể tích của dung dịch trong cuvet, tính bằng mililit (ml);

V₂ là thể tích của dung dịch mẫu thử bổ sung vào cuvet, tính bằng mililit (ml);

F là hệ số pha loãng của dung dịch mẫu (xem 7.1);

d là đường quang của cuvet, tính bằng xentimet (cm);

e là hệ số tắt của NADPH;

ở 340 nm = 6,3          ℓ mmol ^-1 cm^-1;

Hg 365 nm = 3,5        ℓ mmol ^-1 cm^-1;

...

...

...

Nếu thể tích đã cho trong 7.2.2 và 7.2.3 không thay đổi thì hàm lượng D-glucose và D-fructose của mẫu, tính bằng gam/lit, tính được theo Công thức sau:

r(D-glucose) =

5,801 x F x ΔA_D-glucose

e

và

r(D-fructose) =

5,837 x F x ΔA_D-fructose

e

Khi sử dụng bộ kít thử có bán sẵn thì hệ số (5,801 và 5,837) trong các công thức trên có thể khác nhau do tổng thể tích phân tích khác nhau (V₁).

...

...

...

Báo cáo hàm lượng D-glucose hoặc D-fructose, bằng gam trên lít, đến một chữ số thập phân.

9. Độ chụm

Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục A. Các giá trị thu được từ các phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu trong Phụ lục A.

9.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

Các giá trị đó là:

glucose: r = 0,42 + 0,027 r g/l

fructose: r = 0,15 + 0,033 r g/l

Trong đó:

...

...

...

9.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm phân tích, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

Các giá trị đó là:

glucose: R = 1,00 + 0,042 r g/l

fructose: R = 1,05 + 0,045 r g/l

Trong đó:

r là hàm lượng đo được, là trung bình của hai kết quả thử đơn lẻ.

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm:

...

...

...

- viện dẫn tiêu chuẩn này;

- ngày và kiểu quy trình lấy mẫu (nếu có thể);

- ngày nhận mẫu;

- ngày thử nghiệm;

- kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị;

- độ lặp lại của phương pháp đã được đánh giá;

- các điểm cụ thể quan sát được trong quá trình thử nghiệm;

- mọi thao tác không qui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

...

...

...

(Tham khảo)

Các kết quả thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm

Các thông số sau đây thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725:1986 (Đối với tài liệu để đánh giá phương pháp, xem Thư mục Tài liệu tham khảo). Phép thử do Viện Max von Pettenkofer của Tổ chức Y tế liên bang, Cục hóa thực phẩm, Berlin, Đức tổ chức thực hiện.

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm 1983

Số lượng các phòng thử nghiệm                       22

Số lượng mẫu                                                   4

Bảng A.1 - Glucose

Mẫu

A

...

...

...

C

D

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

19

17

15

16

Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ

3

...

...

...

7

6

Số lượng các kết quả được chấp nhận

105

94

80

84

Giá trị trung bình () (g/l)

26,2

...

...

...

53,5

79,9

Độ lệch chuẩn lặp lại (s_r) (g/l)

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD_r) [%]

0,389

1,48

0,562

1,61

0,539

...

...

...

0,959

1,20

Giới hạn lặp lại (r) (g/l)

1,1

1,6

1,5

2,7

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R) (g/l)

Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (RSD_R), %

...

...

...

2,88

1,003

2,87

1,140

2,13

1,403

1,75

Giới hạn tái lập (R) (g/l)

2,1

...

...

...

3,2

3,9

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Determination of glucose and fructose: Enzymatic method: No 55, 1985.

- In: Analyses [Collection]/International Federation of Fruit Juice Producers.

- Loose-leaf edition, as of 1989, - Zug: Swiss Fruit Union.

[2] Untersuchung von Lebensmitteln: Bestimmung von Glucose und Fructose in Fruchtsaften: L31.00-12, 1980-05 [Food Analysis; Determination of glucose and fructose in fruit juices: L31.00-12, 1980-05

In: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG: Verfahren zur Probenahme und Untersuchung von Lebensmitteln, Tabakerzeugnissen, kosmetischen Mitteln und Bedarfsgegenstanden/Bundesgesundheitsamt [In: Collection of official methods under article 35 of the German Federal Foods Act: Methods of sampling and analysis of foods, tobacco products, cosmetics and commodity goods/Federal Health Office]

...

...

...

- Berlin, Koln: Beuth Verlag GmbH.

*) ISO 5725:1986, đã hủy và được thay bằng bộ tiêu chuẩn ISO 5725 (gồm 6 phần) và đã được chấp nhận thành bộ tiêu chuẩn TCVN 6910 (ISO 5725).

1) Hiệp hội enzym (EC): hệ thống phân loại. Sổ tay enzym, Springer, Berlin 1969.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10693:2015 (EN 1140:1994) về Nước rau, quả - Xác định hàm lượng D-glucose và D-fructose sử dụng enzym - Phương pháp đo phổ NADPH