4.3. Các chỉ tiêu vi sinh

Các chỉ tiêu vi sinh của nisin theo quy định trong Bảng 2.

Bảng 2 - Chỉ tiêu vi sinh của nisin

Tên chỉ tiêu

Giới hạn

1. Salmonella

Không được có trong 25 g mẫu

2. Coliform tổng số

Không lớn hơn 30 CFU trong 1 g mẫu

...

...

...

Không được có trong 25 g mẫu

5. Phương pháp thử

5.1. Xác định độ hòa tan, theo 3.7 của TCVN 6469:2010.

5.2. Phép thử phân biệt với các chất kháng khuẩn khác

5.2.1. Độ bền trong môi trường axit

Cho 1 g mẫu thử vào 1 lít dung dịch axit clohydric (HCl) 0,02 N để thu được dung dịch 1 000 IU/ml.

Pha loãng dung dịch 1 000 IU/ml bằng axit clohydric 0,02 N đến nồng độ 50 IU/ml. Đun sôi dung dịch này trong 5 min và xác định hoạt độ nisin theo 5.3.

Nồng độ nisin tính được trong mẫu đun sôi phải đạt 100 % (± 5 %) giá trị định lượng cho biết hoạt độ tổn thất không đáng kể sau quá trình xử lí nhiệt này.

5.2.2. Độ không bền trong môi trường kiềm

...

...

...

Hoạt tính kháng khuẩn của nisin mất hoàn toàn sau quá trình xử lý này.

5.2.3. Khả năng tồn tại của vi khuẩn Lactococcus lactis trong môi trường có nồng độ nisin cao

Chuẩn bị các chủng Lactococcus lactis (ATCC 11454, NCIMB 8586) trong sữa đã tách chất béo tiệt trùng (chất béo sữa < 1 %) và ủ ấm trong 18 h, nhiệt độ 30 ⁰C. Chuẩn bị một hoặc nhiều bình nón chứa 100 ml sữa quỳ (litmus milk), tiệt trùng ở nhiệt độ 121 ⁰C trong 15 min. Cho 0,1 g mẫu vào sữa quỳ đã được tiệt trùng và để ở nhiệt độ phòng trong 2 h. Thêm vào 0,1 ml môi trường L. lactis và ủ ở 30 ⁰C trong 24 h. Vi khuẩn L. lactis sẽ phát triển trong dịch mẫu có nồng độ khoảng 1 000 IU/ml; tuy nhiên, vi khuẩn L. lactis sẽ không phát triển ở các nồng độ tương tự của các chất kháng khuẩn khác.

Phép thử này không phân biệt được nisin và subtilin.

5.3. Xác định hoạt độ nisin

5.3.1. Thuốc thử và vật liệu thử

5.3.1.1. Chuẩn bị vi khuẩn thử

Dùng que cấy chuyển Lactococcus lactis subsp. cremoris (ATCC 14365, NCDO 495) được nuôi cấy hàng ngày trong sữa đã tách chất béo tiệt trùng vào lọ McCartney có chứa sữa quỳ và ủ ở 30 ⁰C. Chuẩn bị sữa chứa vi khuẩn cho phép thử bằng cách cấy 2 % dịch nuôi vi khuẩn 24 h vào lượng tỷ lệ phù hợp sữa đã tách béo tiệt trùng, đặt vào nồi cách thủy ở 30 ⁰C trong 90 min. Sau đó đem dùng ngay.

5.3.1.2. Dung dịch chuẩn gốc

...

...

...

CHÚ THÍCH: Chế phẩm nisin của hãng Sigma, St Louis, USA hoặc Fluka, Buchs, Thụy Sĩ chứa hàm lượng nisin 2,5 % khối lượng với hoạt độ tối thiểu 106 IU/g. Cũng có thể sử dụng chế phẩm Nisaplin của DuPont Nutrition Biosciences, Copenhagen, Đan Mạch chứa hoạt độ tối thiểu 3 x 106 IU/g làm dung dịch chuẩn gốc.

5.3.1.3. Dung dịch resazurin, 0,0125 % (khối lượng/thể tích)

Chuẩn bị dung dịch trong nước ngay trước khi dùng.

5.3.2. Chuẩn bị dung dịch mẫu thử

Cân một lượng mẫu đủ để đảm bảo các ống tương ứng của mẫu phù hợp với dãy dung dịch chuẩn, nghĩa là với các giới hạn chặt chẽ, hàm lượng nisin trong mẫu và chuẩn là như nhau. Pha loãng dung dịch mẫu bằng dung dịch axit clohydric 0,02 N đến hoạt độ nisin 50 IU/ml.

5.3.3. Cách tiến hành

Dùng pipet lấy các thể tích (0,60; 0,55; 050; 0,45; 0,41; 0,38; 0,34; 0,31; 0,28; 0,26 ml) của dung dịch mẫu 50 IU/ml (5.3.2) và dung dịch chuẩn (5.3.1.2) cho vào hai hàng 10 ống nghiệm vi sinh đã được làm khô, kích thước ống 6 inch x 5/8 inch1). Bổ sung 4,6 ml sữa đã cấy vi khuẩn (5.3.1.1) vào từng ống bằng thiết bị pipet tự động. Việc bổ sung sữa đã cấy vi khuẩn phải thực hiện vào từng hàng ống có cùng nồng độ mà không theo từng hàng có 10 ống.

Đặt các ống vào nồi cách thủy ở nhiệt độ 30 ⁰C trong 15 min, sau đó làm nguội trong bể nước đá trong khi thêm vào 1 ml dung dịch resazurin (5.3.1.3) cho mỗi ống, theo thứ tự như khi bổ sung sữa đã cấy vi khuẩn, sử dụng pipet tự động. Lắc đều các ống. Tiếp tục ủ thêm từ 3 min đến 5 min ở nhiệt độ 30 ⁰C trong nồi cách thủy.

Kiểm tra các ống dung dịch chuẩn và dung dịch thử bằng ánh sáng huỳnh quang trong buồng tối. Ống mẫu có nồng độ cao nhất phân biệt rõ trước tiên thông qua màu sắc (ví dụ: chuyển từ màu xanh sang màu hoa cà) được so sánh với các ống trong dãy chuẩn để tìm ra được sự đồng màu nhất. Tìm sự phù hợp ở hai nồng độ thấp hơn kế tiếp của mẫu và chuẩn. Nội suy sự phù hợp ở các bước pha loãng một nửa. Thu được 3 số đọc nồng độ của dung dịch thử và tính giá trị trung bình. Tính hoạt độ nisin trong mẫu thử từ các hoạt độ nisin chuẩn.

...

...

...

5.4. Xác định hao hụt khối lượng sau khi sấy, theo 5.1 của TCVN 8900-2:2012.

5.5. Xác định hàm lượng natri clorua

5.5.1. Thuốc thử

5.5.1.1. Axit nitric đặc.

5.5.1.2. Nitrobenzen.

5.5.1.3. Dung dịch bạc nitrat, 0,1 N.

5.5.1.4. Thuốc thử sắt (III) amoni sulfat [FeNH₄(SO₄)₂.12H₂O] trong nước, 8 % (khối lượng/thể tích).

5.5.1.5. Dung dịch amoni thiocyanat, 0,1 N.

5.5.1.6. Nước cất hoặc nước có chất lượng tương đương.

...

...

...

5.5.2.1. Cân phân tích, có thể cân chính xác đến 0,1 mg.

5.5.2.2. Pipet.

5.5.2.3. Buret.

5.5.3. Cách tiến hành

Cân khoảng 200 mg mẫu thử, chính xác đến 0,1 mg, cho vào bình thủy tinh có nắp đậy, chứa sẵn 50 ml nước. Khuấy để hòa tan mẫu đồng thời thêm 3 ml axit nitric (5.5.1.1), 5 ml nitrobenzen (5.5.1.2), 50,0 ml dung dịch bạc nitrat 0,1 N (5.5.1.3) đã chuẩn hóa và 2 ml thuốc thử sắt (III) amoni sulfat (5.5.1.4). Khuấy dung dịch và chuẩn độ lượng bạc nitrat dư bằng dung dịch amoni thiocyanat 0,1 N (5.5.1.5). Kết thúc chuẩn độ khi xuất hiện màu đỏ.

5.5.4. Tính kết quả

Hàm lượng natri clorua có trong mẫu thử, X, biểu thị theo phần trăm khối lượng, được tính theo công thức sau:

Trong đó:

...

...

...

50 là thể tích của dung dịch bạc nitrat, tính bằng mililit (ml);

C_A là nồng độ của dung dịch bạc nitrat;

V là thể tích dung dịch amoni thiocyanat, tính bằng mililit (ml);

C_B là nồng độ của dung dịch amoni thiocyanat;

w là khối lượng mẫu thử, tính bằng miligam (mg).

5.6. Xác định hàm lượng chì, theo TCVN 8900-6:2012 hoặc TCVN 8900-8:2012.

5.7. Xác định Salmonella, theo JECFA 2006, Volume 4.

5.8. Xác định coliform tổng số, theo JECFA 2006, Volume 4.

5.9. Xác định Escherichia coli, theo JECFA 2006, Volume 4.

...

...

...

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10637:2015 về Phụ gia thực phẩm - Nisin