9.4.11. Thực hiện chiết lần hai bằng cách lặp lại các thao tác theo quy định trong 9.4.4 đến hết 9.4.9. Chỉ dùng 15 ml dietyl ete (5.4) và 15 ml dầu nhẹ (5.5) thay vì dùng 25 ml. Dùng dietyl ete để tráng thành trong của cổ bình chiết chất béo.

Nếu cần, nâng cao mặt lớp phân cách đến giữa cổ bình bằng cách nhẹ nhàng thêm nước theo thành bình (xem Hình 1) để gạn được dung môi càng triệt để càng tốt (xem Hình 2).

9.4.12. Thực hiện chiết lần ba, không thêm etanol, bằng cách lặp lại các thao tác theo quy định trong 9.4.4 đến 9.4.9. Chỉ sử dụng 15 ml dietyl ete (5.4) và 15 ml dầu nhẹ (5.5). Dùng dietyl ete để tráng bên trong cổ bình chiết chất béo.

Nếu cần, nâng cao mặt lớp phân cách đến giữa cổ bình bằng cách nhẹ nhàng thêm nước theo thành bình (xem Hình 1) để gạn được dung môi càng triệt để càng tốt (xem Hình 2).

9.4.13. Loại bỏ các dung môi (kể cả etanol) ra khỏi bình thu nhận chất béo càng triệt để càng tốt bằng cách chưng cất nếu sử dụng bình đun sôi hoặc bình nón, hoặc bằng cách làm bay hơi nếu sử dụng cốc có mỏ hoặc đĩa (6.3). Tráng bên trong của cổ bình đun sôi hoặc bình nón bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.6) trước khi bắt đầu chưng cất.

9.4.14. Đun nóng bình thu nhận chất béo trong tủ sấy (6.4) được duy trì nhiệt độ 102 °C trong thời gian 1 h, đối với bình nón hoặc bình đun sôi thì đặt chúng nằm nghiêng để hơi dung môi thoát ra được. Lấy bình thu nhận chất béo ra khỏi tủ sấy và kiểm tra ngay xem chất béo đã trong hay chưa. Nếu chất béo không trong thì có thể chứa tạp chất béo và phải lặp lại toàn bộ quy trình. Nếu chất béo trong thì bảo vệ bình thu nhận chất béo khỏi bụi và để nguội bình (không để trong bình hút ẩm) đến nhiệt độ phòng cân (đối với bình thu nhận chất béo bằng thuỷ tinh thì ít nhất là 1 h còn đối với đĩa kim loại thì ít nhất là 30 min).

Không lau bình thu nhận chất béo ngay trước khi cân. Dùng bộ kẹp (6.13) để đặt bình thu nhận chất béo lên cân. Cân bình thu nhận chất béo, chính xác đến 1,0 mg.

9.4.15. Đun nóng bình thu nhận chất béo thêm 30 min trong tủ sấy (6.4) được duy trì nhiệt độ 102 °C, đối với bình nón hoặc bình đun sôi thì đặt chúng nằm nghiêng để hơi dung môi thoát ra được. Để nguội và cân lại theo 9.4.14. Nếu cần, lặp lại các quy trình đun nóng và cân cho đến khi chênh lệch khối lượng của bình thu nhận chất béo giữa hai lần cân liên tiếp bằng hoặc nhỏ hơn 1,0 mg. Ghi lại giá trị nhỏ nhất, giá trị này được coi là khối lượng bình thu nhận chất béo và chất chiết được.

10. Tính và biểu thị kết quả

...

...

...

Tính hàm lượng chất béo của mẫu thử, w_f, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng, theo Công thức (1):

                                                                        (1)

Trong đó:

m₀ là khối lượng của phần mẫu thử (9.1), tính bằng gam (g);

m₁ là khối lượng của bình thu nhận chất béo và chất chiết được, xác định được trong 9.4.15, tính bằng gam (g);

m₂ là khối lượng của bình thu nhận chất béo đã chuẩn bị (9.2), tính bằng gam (g);

m₃ là khối lượng của bình thu nhận chất béo sử dụng trong phép thử trắng (9.2) và chất chiết xác định được trong 9.4.15, tính bằng gam (g);

m₄ là khối lượng của bình thu nhận chất béo (9.3) sử dụng trong phép thử trắng (9.2), tính bằng gam (g).

10.2. Biểu thị kết quả

...

...

...

11. Độ chụm

11.1. Phép thử liên phòng thử nghiệm

Các chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725:19861) (xem Tài liệu tham khảo ^[2]) về độ chụm của phương pháp).

Các giá trị về độ lặp lại và độ tái lập được biểu thị theo mức xác suất 95 % và có thể không thể áp dụng cho các dải nồng độ và các nền mẫu khác với các dải nồng độ và các nền mẫu đã nêu.

11.2. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ độc lập, thu được khi sử dụng cùng một phương pháp, trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn 0,50 % khối lượng chất béo trong mẫu thử.

VÍ DỤ Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đối với cream có hàm lượng chất béo 20 % khối lượng không lớn hơn 0,10 g chất béo trên 100 g mẫu thử và sự chênh lệch đối với cream 80 % khối lượng chất béo không lớn hơn 0,40 g chất béo trên 100 g mẫu thử.

11.3. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm riêng rẽ độc lập, thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do những người phân tích khác nhau thực hiện, sử dụng các thiết bị khác nhau trong các phòng thử nghiệm khác nhau, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn 1,00 % khối lượng chất béo trong mẫu thử.

...

...

...

12. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm các thông tin sau:

a) mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử;

b) phương pháp lấy mẫu đã sử dụng, nếu biết;

c) phương pháp thử đã sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này;

d) tất cả các thao tác chi tiết không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tuỳ chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả;

e) việc hiệu chính, nếu giá trị thu được trong phép thử trắng đối với phương pháp lớn hơn 2,5 mg;

f) kết quả thử nghiệm thu được hoặc nếu kiểm độ lặp lại thì ghi kết quả cuối cùng thu được.

...

...

...

(Tham khảo)

Một số chú ý về cách tiến hành

A.1. Phép thử trắng để kiểm tra thuốc thử (xem 9.2.2)

Trong phép thử trắng này, bình thu nhận chất béo dùng để kiểm chứng khối lượng được sử dụng để đảm bảo các thay đổi trong điều kiện môi trường của phòng cân hoặc ảnh hưởng nhiệt độ của bình thu nhận chất béo không làm ảnh hưởng đến việc xem xét sự có mặt hay không có mặt của chất không bay hơi có trong phần chiết của thuốc thử. Bình này có thể được dùng như bình đối trọng trong trường hợp cân có hai đĩa cân. Mặt khác, chênh lệch khối lượng biểu kiến (m₃ - m₄ trong công thức ở 10.1) của bình thu nhận chất béo dùng để kiểm chứng phải được xem xét khi kiểm tra khối lượng của bình thu nhận chất béo dùng trong phép thử trắng. Do đó, sự thay đổi khối lượng biểu kiến của bình thu nhận chất béo, được điều chỉnh theo sự thay đổi khối lượng biểu kiến của bình thu nhận chất béo dùng để kiểm chứng, không được tăng quá 1,0 mg.

Rất hiếm khi các dung môi có chứa chất dễ bay hơi bị giữ lại nhiều trong chất béo. Nếu thấy sự có mặt của các chất như thế, cần tiến hành phép thử trắng đối với tất cả thuốc thử và đối với từng dung môi thì sử dụng bình thu nhận chất béo với khoảng 1 g butterfat khan. Nếu cần, chưng cất lại các dung môi với sự có mặt của 1 g butterfat trong 100 ml dung môi. Chỉ dùng các dung môi này trong khoảng thời gian ngắn sau khi chưng cất lại.

A.2. Phép thử trắng được tiến hành đồng thời với phép xác định (xem 9.2.1)

Giá trị thu được trong phép thử mẫu trắng tiến hành đồng thời với phép xác định, cho khối lượng biểu kiến của các chất chiết được từ phần mẫu thử (m₁ - m₂) được hiệu chính theo sự có mặt của các chất không bay hơi chiết được từ thuốc thử và cũng như bất kì sự thay đổi nào về điều kiện môi trường của phòng cân và chênh lệch nhiệt độ giữa bình thu nhận chất béo và phòng cân trong hai lần cân (9.4.15 và 9.3).

Trong các điều kiện thích hợp (phép thử trắng đối với thuốc thử cho giá trị thấp, nhiệt độ phòng cân không thay đổi, thời gian làm nguội bình thu nhận chất béo là thích hợp) thì giá trị này thường nhỏ hơn 1,0 mg và sau này có thể được bỏ qua trong phần tính kết quả trong phép xác định thông thường. Cũng thường gặp giá trị lớn hơn đến 2,5 mg (dương và âm). Sau khi hiệu chính các giá trị này, các kết quả sẽ đúng. Khi phải hiệu chính giá trị lớn hơn 2,5 mg thì phải đề cập trong báo cáo thử nghiệm (Điều 12).

Nếu giá trị thu được trong phép thử trắng thường lớn hơn 1,0 mg thì cần kiểm tra thuốc thử nếu trước đó chưa kiểm tra. Thuốc thử có lẫn tạp chất hoặc có vết thì cần phải thay mới hoặc làm sạch lại (xem 9.2.2 và A.1).

...

...

...

Để thử peroxit, cho 1 ml dung dịch kali iodua 100 g/l mới chuẩn bị vào 10 ml dietyl ete (5.4) đựng trong ống đong nhỏ có nắp thuỷ tinh đã được tráng bằng ete. Lắc ống đong rồi để yên 1 min. Lớp dietyl ete không được có màu vàng.

Có thể sử dụng các phương pháp thử nghiệm thích hợp khác đối với peroxit.

Để đảm bảo cho dietyl ete không chứa peroxit, xử lí ete ít nhất là ba ngày trước khi sử dụng như sau: Cắt lá kẽm thành những dải để ít nhất là chúng chạm được đến nửa chai đựng dietyl ete, dùng khoảng 8000 mm² lá kẽm cho 1 lít dietyl ete.

Trước khi sử dụng, nhúng toàn bộ các dải lá kẽm này 1 min trong dung dịch chứa 10 g đồng (II) sulfat ngậm năm phân tử nước (CuSO₄.5H₂O) và 2 ml axit sulfuric đậm đặc (98 % khối lượng) trên lít. Rửa kỹ các dải lá kẽm nhẹ nhàng bằng nước, rồi đặt các dải đã được mạ đồng còn ẩm này vào trong chai đựng dietyl ete và để chúng vào trong chai.

Có thể dùng các phương pháp khác với điều kiện là không làm ảnh hưởng đến kết quả xác định.

A.4. Dietyl ete có chứa chất chống oxi hoá

Dietyl ete có chứa chất chống oxi hoá với nồng độ khoảng 1 mg/kg có thể có bán sẵn, đặc biệt dùng để xác định chất béo. Hàm lượng này không dùng để đối chứng.

Sản phẩm dietyl ete bán sẵn có thể chứa hàm lượng chất chống oxi hoá cao hơn, ví dụ: đến 7 mg/kg. Những loại như thế chỉ nên sử dụng trong phép xác định thông thường và phải tiến hành phép thử trắng đồng thời với phép xác định, để hiệu chính những sai số hệ thống do dư lượng của chất chống oxi hoá gây ra. Phải chưng cất loại dietyl ete này trước khi dùng để đối chứng.

A.5. Etanol

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Quy trình thay thế dùng ống chiết chất béo có si phông hoặc có nối với chai rửa

B.1. Yêu cầu chung

Nếu sử dụng ống chiết chất béo có si phông hoặc có nối với chai rửa thì sử dụng quy trình quy định trong phụ lục này. Các ống này phải có nắp đậy hoặc nút bần chất lượng tốt như được quy định đối với bình chiết trong 6.6 (xem Hình B.1 như một ví dụ).

B.2. Cách tiến hành

B.2.1. Chuẩn bị mẫu thử

Xem Điều 8.

...

...

...

Tiến hành theo 9.1 nhưng dùng các ống chiết chất béo (xem Chú thích trong 6.6 và Hình B.1).

Phần mẫu thử này phải chuyển được vào đáy của ống chiết chất béo càng triệt để càng tốt.

B.2.3. Phép thử trắng

Xem 9.2 và A.2.

B.2.4. Chuẩn bị bình thu nhận chất béo

Xem 9.3.

B.2.5. Phép xác định

B.2.5.1. Tiến hành xác định ngay.

Thêm một lượng nước ở khoảng 50 °C vào phần mẫu thử đựng trong ống chiết chất béo (B.2.2) để thu được tổng thể tích từ 10 ml đến 11 ml. Dùng nước để rửa phần mẫu thử vào bầu nhỏ của ống chiết chất béo. Trộn kỹ phần mẫu thử trong bầu nhỏ. Làm nguội phần mẫu thử, đến nhiệt độ phòng dưới dòng nước chảy.

...

...

...

a) có gắn ống si phông

b) có gắn bình rửa

CHÚ DẪN

^a Dung tích khi tháo khớp nối 105 ml ± 5 ml.

^b Độ dày của thành 1,5 mm ± 0,5 mm.

Hình B.1 - Các ví dụ về ống chiết chất béo

B.2.5.3. Thêm 10 ml etanol (5.2). Trộn kỹ một cách nhẹ nhàng trên đáy của ống chiết chất béo. Nếu cần, thêm 2 giọt dung dịch đỏ Congo (5.3).

B.2.5.4. Thêm 25 ml dietyl ete (5.4). Đậy nắp ống chiết chất béo bằng nút bần đã bão hoà nước hoặc đậy bằng nắp làm bằng vật liệu khác đã được làm ẩm bằng nước (6.6). Lắc ống chiết bằng cách đảo chiều trong 1 min, nhưng không quá mạnh để tránh tạo nhũ. Nếu cần, làm nguội ống dưới dòng nước chảy. Mở nút bần hoặc nắp ống chiết một cách cẩn thận, tráng nắp và cổ ống chiết bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.6). Sử dụng chai rửa (6.8) sao cho nước rửa chảy vào ống.

...

...

...

B.2.5.6. Li tâm ống chiết chất béo đã đậy kín trong máy li tâm (6.2) trong thời gian từ 1 min đến 5 min ở gia tốc quay từ 80g đến 90g. Nếu không có máy li tâm thì để yên ống trên giá đỡ (6.7) ít nhất 30 min cho đến khi thấy có lớp nổi lên bề mặt rõ rệt và phân biệt rõ với lớp nước. Nếu cần, làm nguội ống dưới dòng nước chảy đến nhiệt độ phòng.

B.2.5.7. Cẩn thận tháo nút bần hoặc nắp ống chiết, tráng nắp và cổ ống chiết chất béo bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.6). Sử dụng chai rửa (6.8) sao cho nước rửa chảy vào ống.

B.2.5.8. Lắp khớp nối si phông hoặc nối với chai rửa vào ống chiết chất béo. Đẩy ống nối bên trong đến khoảng 4 mm cao hơn mặt tiếp xúc giữa các lớp. Ống nối phía bên trong phải song song với trục của ống chiết chất béo.

Cẩn thận gạn lớp nổi trên bề mặt của ống chiết chất béo vào bình thu nhận chất béo (xem 9.3) có chứa vài hạt trợ sôi (6.10) trong trường hợp đối với bình đun sôi hoặc bình nón (đối với đĩa kim loại thì tuỳ chọn). Tránh không để lớp nước lẫn vào. Tráng phía ngoài khớp nối bằng một ít dung môi hỗn hợp, thu lấy nước rửa vào bình thu nhận chất béo.

CHÚ THÍCH: Lớp nổi phía trên có thể được chuyển ra khỏi ống chiết chất béo, ví dụ như bằng cách dùng bầu cao su được nối với một thân ngắn để tạo áp lực.

B.2.5.9. Nới lỏng khớp nối khỏi cổ của ống chiết chất béo. Nâng nhẹ ống nối và tráng phần thấp hơn của ống nối bên trong bằng một ít dung môi hỗn hợp (5.6). Hạ thấp và lắp lại ống nối và chuyển nước rửa vào bình thu nhận chất béo.

Tráng rửa lại khớp nối bằng một ít dung môi hỗn hợp, cho nước rửa vào bình thu nhận chất béo.Tốt nhất là loại bỏ dung môi hoặc một phần dung môi khỏi bình thu nhận chất béo bằng cách chưng cất hoặc làm bay hơi nêu trong 9.4.13.

B.2.5.10. Tháo khớp nối khỏi cổ của ống. Nâng nhẹ ống nối và thêm 5 ml etanol vào lượng chứa trong ống chiết chất béo. Dùng etanol để tráng thành trong của khớp nối. Trộn theo B.2.5.3.

B.2.5.11. Thực hiện chiết lần hai bằng cách lặp lại các thao tác theo quy định trong B.2.5.4 đến B.2.5.9. Dùng 15 ml dietyl ete (5.4) và 15 ml dầu nhẹ (5.5) thay vì 25 ml. Dùng dietyl ete để tráng thành trong của khớp nối trong quá trình tháo khớp nối ra khỏi ống chiết chất béo sau lần chiết trước đó.

...

...

...

B.2.5.13. Tiến hành theo quy định trong 9.4.13 đến 9.4.15.

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu.

[2] ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests.

[3] TCVN 6688-3 (ISO 8262-3), Sản phẩm sữa và thực phẩm từ sữa - Xác định hàm lượng chất béo bằng phương pháp khối lượng Weibull-Berntrop (Phương pháp chuẩn) - Phần 3: Các trường hợp đặc biệt.

[4] International Dairy Federation. Interlaboratory Collaborative Studies, Second series. Bull.Int. Dairy Fed. 1988 (235).

1) ISO 5725:1986 (hiện nay đã bị huỷ) được sử dụng để thu được các số liệu về độ chụm.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10563:2015 (ISO 2450:2008) về Cream - Xác định hàm lượng chất béo - Phương pháp khối lượng (Phương pháp chuẩn)