Lượng NADH tạo thành (đo được bằng sự tăng độ hấp thụ cực tím của dung dịch) tương đương với lượng D-malat có mặt.

D-malat dehydrogenase không phải là 100 % đặc trưng cho axit D-malic. Chất này phản ứng với axit L-tartaric ở tốc độ thấp hơn nhiều. Nếu cần phải phân tích axit D-malic khi có mặt axit tartaric với nồng độ cao như trong rượu vang thì mẫu phải được xử lý trước để loại bỏ axit tartaric.

5. Thuốc thử

5.1. Yêu cầu chung

Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước đạt loại 3 trong TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987).

CHÚ THÍCH: Có thể thực hiện phép thử sử dụng các thuốc thử đơn lẻ.

5.2. Bộ kit thử kết hợp, bộ kit thử Boehringer Mannheim2) bao gồm:

5.2.1. Chai 1 gồm khoảng 30 ml dung dịch chứa chất đệm HEPES. (axit 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine ethansulfonic), pH = 9,0 và các chất ổn định.

5.2.2. Chai 2 gồm khoảng 210 mg NAD khô lạnh;

...

...

...

5.3. Canxi hydroxit.

5.4. Etanol khoảng 98 %.

5.5. Kali hydroxit.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm và các thiết bị, dụng cụ sau:

6.1. Pipet dùng để thử enzym, được chia độ dọc theo thân, có đầu tip phân phối dài, không chia độ.

6.2. Pipet, có độ chính xác tương đương với 6.1, ví dụ: pipet mao quản dịch chuyển dương.

6.3. Cuvet, bằng thạch anh, thủy tinh hoặc chất dẻo, có chiều dài đường quang 10 mm và hấp thụ không đáng kể ở bước sóng 334 nm, 340 nm hoặc 365 nm.

6.4. Máy đo quang phổ vạch, có đèn thủy ngân và bộ lọc để đo ở bước sóng 365 nm hoặc 334 nm.

...

...

...

6.6. Bình định mức, dung tích 50 ml.

6.7. Bộ lọc màng, có cỡ lỗ 0,2 mm.

7. Cách tiến hành

7.1. Chuẩn bị mẫu thử

7.1.1. Chuẩn bị mẫu thông thường

Thông thường các mẫu không cần xử lý trước, tuy nhiên có thể cần pha loãng và phép phân tích theo phương pháp này nên dựa vào thể tích, các kết quả được biểu thị trên 1 lít mẫu. Đối với các mẫu cô đặc, có thể cũng tiến hành phân tích dựa vào thể tích, sau khi pha loãng đến tỷ trọng tương đối đã biết. Trong trường hợp này, tỷ trọng tương đối phải được nêu rõ. Dựa vào lượng mẫu đã cân và hệ số pha loãng, các kết quả có thể cũng được biểu thị trên 1 kg mẫu. Đối với các sản phẩm có độ nhớt cao và/hoặc có chứa lượng thịt quả rất cao thì thường tiến hành phép xác định theo khối lượng mẫu thử.

Làm trong các mẫu đục chứa nồng độ axit D-malic thấp bằng cách ly tâm trước hoặc lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,2 mm (6.7).

7.1.2. Chuẩn bị các mẫu thử chứa các mức axit tartaric cao

Lấy 25 ml nước quả và trộn với 125 mg canxi hydroxit (5.3) và 5 ml etanol (5.4) (xấp xỉ 98 %) trong 2 min. Chỉnh pH của dung dịch đến khoảng từ 7 đến 8 bằng dung dịch kali hydroxit (5.5), chuyển định lượng vào bình định mức 50 ml (6.6) và pha loãng đến vạch. Làm trong dung dịch (như trong 7.1.1) và sử dụng dung dịch trong không màu trong phép phân tích bằng enzym.

...

...

...

7.2.1. Yêu cầu chung

Tiến hành phép xác định trong khoảng nhiệt độ từ 20 °C đến 25 °C hoặc nhiệt độ không đổi trong khoảng từ 25 °C đến 37 °C để thu được các kết quả tương tự.

Độ hấp thụ tối đa của NADH là ở bước sóng 340 nm. Khi sử dụng máy đo phổ có bước sóng thay đổi (6.5) thì chỉ đo ở bước sóng có độ hấp thụ tối đa. Khi sử dụng máy đo quang phổ vạch có đèn bay hơi thủy ngân (6.4) thì đo ở bước sóng 334 nm hoặc 365 nm.

Không sử dụng pipet phân phối một vạch để lấy dung dịch. Có thể dùng pipet tự động thích hợp để bổ sung các dung dịch enzym, co-enzym và dung dịch đệm. Sử dụng pipet dùng cho phép thử enzym (6.1) hoặc pipet tương đương (6.2) để lấy dung dịch mẫu.

Nên dùng axit D-malic làm dung dịch chuẩn trong phép thử này.

7.2.2. Dung dịch thử trắng

Dùng pipet lấy 1,00 ml chất đệm HEPES (5.2.1), 0,10 ml dung dịch NAD (5.2.2), 1,80 ml nước cho vào cuvet. Trộn và sau 6 min, đọc độ hấp thụ (A_{1mẫu trắng}) so với không khí (không có cuvet trong đường quang).

7.2.3. Dung dịch mẫu thử

Dùng pipet lấy 1,00 ml chất đệm HEPES (5.2.1), 0,10 ml dung dịch NAD (5.2.2), 1,70 ml nước và 0,10 ml dung dịch mẫu thử cho vào cuvet. Trộn và sau 6 min, đọc độ hấp thụ (A_{1mẫu thử}) so với không khí (không có cuvet trong đường quang).

...

...

...

Khi bổ sung 0,05 ml dung dịch D-MDH (5.2.3) vào từng dung dịch nêu trong 7.2.2 và 7.2.3 thì phản ứng bắt đầu xảy ra. Trộn và đợi cho đến khi kết thúc phản ứng (khoảng 20 min) và đọc độ hấp thụ (A₂) của dung dịch so với không khí. Nếu phản ứng chưa kết thúc sau 20 min thì cứ sau 5 min tiếp tục đọc độ hấp thụ cho đến khi độ hấp thụ tăng với tốc độ không đổi và ngoại suy ngược lại kể từ khi thêm dung dịch D-MDH enzym cuối cùng. (Quy trình này cho phép có phản ứng phụ và được gọi là phản ứng trượt nêu trong Phụ lục A).

8. Tính kết quả

Dựa vào phản ứng của phép xác định, có tỷ lệ tuyến tính giữa lượng NADH tạo thành (có chênh lệch độ hấp thụ) và nồng độ axit D-malic, được tính theo Công thức (1):

DA = (A₂ - A₁)_{mẫu thử} - (A₂ - A₁)_{mẫu trắng}                                              (1)

Tính nồng độ chất trong dung dịch pha loãng bằng cách đo độ hấp thụ theo định luật Beer-Lambert. Hàm lượng axit D-malic của mẫu (tính bằng gam trên lít), tính được theo Công thức (2):

                                            (2)

Trong đó:

M là khối lượng phân tử của axit D-malic (134,09 gmol^-1);

V là tổng thể tích của dung dịch thử trong cuvet, tính bằng mililit (ml);

...

...

...

d là chiều dài đường quang của cuvet, tính bằng centimet (cm);

e là hệ số tắt của NADH:

ở bước sóng 340 nm = 6,3 (l.mmol^-1.cm^-1)

ở bước sóng 365 nm = 3,4 (l.mmol^-1.cm^-1)

ở bước sóng 334 nm = 6,18 (l.mmol^-1.cm^-1)

Nếu sử dụng các thể tích nêu trong 7.2 thì axit D-malic, tính bằng gam trên lít (g/l), theo Công thức (3):

                                            (3)

Cần tính đến mọi hệ số pha loãng và mối liên hệ với khối lượng hoặc thể tích trong phép tính cuối cùng. Nếu sản phẩm đặc đã được pha loãng đến nồng độ đơn (nồng độ ban đầu) thì phải ghi lại tỷ trọng tương đối của mẫu có nồng độ đơn đó.

Báo cáo hàm lượng axit D-malic bằng gam trên lít (g/l) đến một chữ số thập phân.

...

...

...

Chi tiết của phép thử liên phòng thử nghiệm về độ chụm của phương pháp được nêu trong Phụ lục B. Các giá trị thu được từ các phép thử liên phòng thử nghiệm này có thể không áp dụng được cho các dải nồng độ và nền mẫu khác với các dải nồng độ và nền mẫu đã nêu trong Phụ lục B.

9.1. Độ lặp lại

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do cùng một người phân tích, sử dụng cùng một thiết bị, trong một khoảng thời gian ngắn, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.

Độ lặp lại là: r = 2,03 + 0,044 x r_{(axit D-malic)} mg/l

Trong đó:

r_{(axit D-malic)} là hàm lượng đo được

9.2. Độ tái lập

Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả thử nghiệm đơn lẻ thu được khi tiến hành thử trên vật liệu thử giống hệt nhau, do hai phòng thử nghiệm phân tích, không được quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.

Độ tái lập là: R = 6,46 + 0,108 x r_{(axit D-malic)} mg/l

...

...

...

10. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm:

- mọi thông tin cần thiết để nhận biết mẫu (loại mẫu, nguồn gốc mẫu, ký hiệu);

- viện dẫn tiêu chuẩn này;

- ngày và phương pháp lấy mẫu (nếu biết);

- ngày nhận mẫu;

- ngày thử nghiệm;

- kết quả thử nghiệm và các đơn vị biểu thị;

- độ lặp lại của phương pháp đã được đánh giá;

...

...

...

- mọi thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này, hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả thử nghiệm.

Phụ lục A

(Tham khảo)

Thông tin về việc xử lý các phản ứng “trượt”

Phản ứng "trượt" là do phản ứng phụ của enzym, khi có mặt của các enzym khác trong nền mẫu, hoặc tác động tương hỗ của một hoặc nhiều thành phần nền mẫu với đồng hệ số của phản ứng enzym.

Trong phản ứng thông thường độ hấp thụ giữ nguyên giá trị không đổi sau thời gian chính phụ thuộc vào tốc độ của phản ứng của loại enzym cụ thể, điển hình từ 10 min đến 20 min. Tuy nhiên, khi xuất hiện phản ứng phụ thì độ hấp thụ không đạt đến giá trị ổn định nhưng tăng đều theo thời gian và quy trình này thường được gọi là phản ứng “trượt”.

Nếu có phản ứng phụ xảy ra thì độ hấp thụ của dung dịch sẽ đo được ở khoảng cách đều nhau (2 min đến 5 min) sau thời gian cần để dung dịch chuẩn đạt đến độ hấp thụ cuối cùng. Khi độ hấp thụ tăng với tốc độ không đổi thì lấy 5 số đọc đến 6 số đọc và sau đó ngoại suy bằng đồ thị hoặc phép toán học đối với độ hấp thụ của dung dịch có ở một điểm khi enzym cuối dùng được thêm vào (T₀). Sử dụng chênh lệch độ hấp thụ (A_f - A_i) để tính nồng độ cơ chất.

...

...

...

Phụ lục B

(Tham khảo)

Các kết quả thống kê của phép thử liên phòng thử nghiệm

Các thông số sau đây thu được trong phép thử liên phòng thử nghiệm phù hợp với ISO 5725:1986 (Đối với tài liệu liên quan đến phương pháp, xem Thư mục tài liệu tham khảo). Phép thử do Hiệp hội Quả quốc tế, Paris, Pháp tổ chức thực hiện.

Năm tiến hành phép thử liên phòng thử nghiệm 1991

Số lượng các phòng thử nghiệm                       24/18

Số lượng mẫu                                                   3 có bổ sung axit D-malic

Loại mẫu:

...

...

...

B nước táo;

C nước nho đỏ.

Bảng B.1 - Kết quả của phép thử liên phòng thử nghiệm

Mẫu

A

B

C

Số lượng phòng thử nghiệm được giữ lại sau khi trừ ngoại lệ

19

...

...

...

15

Số lượng phòng thử nghiệm ngoại lệ

5

-

3

Số lượng các kết quả được chấp nhận

77

101

61

...

...

...

80,3

98,2

514,4

Độ lệch chuẩn lặp lại (s_r) (mg/l)

1,62

2,64

8,75

Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại (RSD_r) [%]

2,0

...

...

...

1,7

Giới hạn lặp lại (r) (mg/l)

4,5

7,5

24,8

Độ lệch chuẩn tái lập (s_R) (mg/l)

4,90

6,53

21,87

...

...

...

6,1

6,8

4,3

Giới hạn tái lập (R) (mg/l)

13,7

18,5

61,9

CHÚ THÍCH: Có mối liên hệ tuyến tính giữa r, R và hàm lượng r.

...

...

...

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] D-Malic acid enzymatic method: Official Journal of the European Communities, L 272, Volume 33, pages 106 - 108, puslished 3.10.90

[2] Determination of the D-malic acid content: No. 64, 1994. In: The collected Analyses of the International Federation of Fruit Juice Producers. Loose-leaf edition, as of 1996-Zug: Swiss Fruit Union.

[3] Methods of enzymatic food analysis, Boehringer Mannheim.

1) ISO 5725:1986. Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory test dùng để thu được dữ liệu về độ chụm. Tiêu chuẩn này đã hủy và được thay bằng bộ tiêu chuẩn ISO 5725 (gồm 6 phần) và đã được chấp nhận thành bộ TCVN 6910 (ISO 5725).

2) Boehringer Mannheim là ví dụ về sản phẩm thích hợp có bán sẵn. Thông tin đưa ra tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn này và không ấn định phải sử dụng chúng.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10388:2014 (EN 12138:1997) về Nước rau, quả - Xác định hàm lượng axit D-malic bằng enzym - Phương pháp đo phổ NAD