5.1.2. Dung dịch gốc B

Kali natri tartrat ngậm bốn phân tử nước (KNaC₄H₄O₆.4H₂O)

346.0 g

Natri hydroxit (NaOH)

100,0 g

Nước, vừa đủ

1 000,0 ml

Trước khi sử dụng, gạn lấy dung dịch trong, nếu có cặn.

5.1.3. Dung dịch Fehling hỗn hợp

...

...

...

CHÚ THÍCH: Không lưu giữ dung dịch Fehling. Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp này ngay trước khi sử dụng và chuẩn hóa như quy định trong 7.1

5.2. D-glucose khan, đáp ứng các yêu cầu sau

a) Dung dịch nồng độ 400 g/l không được đục, không có cặn và màu không được đậm hơn màu nước sử dụng để chuẩn bị dung dịch này, được kiểm tra bằng cách cho đầy đến vạch ống Nessler 50 ml (6.5).

b) Hàm lượng tro sulfat không được lớn hơn 0,01 % (khối lượng) so với hàm lượng khi xác định bằng phương pháp quy định trong TCVN 9940 (ISO 5809) với những điều chỉnh như sau:

1) khối lượng của phần mẫu thử phải tăng đến 20 g,

2) chỉ sử dụng đĩa platin để nung,

3) đĩa platin phải được cân chính xác đến 0,1 mg trước và sau khi nung;

c) Hàm lượng maltose và/hoặc isomaltose không được vượt quá 0,1 % (khối lượng) và không phát hiện với đường có khối lượng phân tử tương đối lớn hơn.

5.3. D-glucose, dung dịch so sánh chuẩn.

...

...

...

5.3.2. Cân một lượng D-glucose khan (5.2) có chứa 0,600 g chất khô, chính xác đến 0,1 mg, hòa tan lượng này trong nước, chuyển định lượng dung dịch vào bình định mức một vạch 100 ml (6.4), pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.

Chuẩn bị dung dịch này ngay trong ngày sử dụng.

5.4. Chất chỉ thị xanh metylen (C₁₆H₁₈ClN₂S.2H₂O), dung dịch nước 1 g/l.

6. Thiết bị, dụng cụ

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ thông thường của phòng thử nghiệm, cụ thể như sau:

6.1. Bình đun sôi cổ hẹp, dung tích 250 ml, phù hợp với các yêu cầu trong ISO 1773.

6.2. Buret, dung tích 25 ml, được chia vạch đến 0,05 ml, phù hợp với yêu cầu loại A trong TCVN 7149 (ISO 385).

6.3. Pipet một vạch, dung tích 1 ml và 25 ml, phù hợp với yêu cầu loại A trong TCVN 7151 (ISO 648).

6.4. Bình định mức một vạch, dung tích 100 ml, 500 ml và 1 000 ml phù hợp với các yêu cầu loại A trong TCVN 7153 (ISO 1042).

...

...

...

6.6. Thiết bị gia nhiệt, thích hợp để duy trì quá trình sôi như yêu cầu trong 7.1.4 trong khi vẫn có thể quan sát được sự thay đổi màu ở điểm kết thúc chuẩn độ mà không cần phải lấy bình ra khỏi thiết bị gia nhiệt.

6.7. Đồng hồ bấm giờ.

7. Cách tiến hành

CHÚ THÍCH 1: Để không sôi quá mạnh có thể thêm vài viên trợ sôi (ví dụ các viên thủy tinh), nếu cần.

CHÚ THÍCH 2: Luôn để buret cách xa nguồn nhiệt (6.6).

7.1. Chuẩn hóa dung dịch Fehling hỗn hợp (5.1.3)

7.1.1. Dùng pipet (6.3) lấy 25,0 ml dung dịch Fehling (5.1.3) cho vào bình đun sôi (6.1) khô, sạch.

7.1.2. Rót dung dịch so sánh chuẩn D-glucose (5.3) vào buret (6.2) đến vạch zero.

7.1.3. Từ buret cho 18,0 ml dung dịch D-glucose (5.3) chảy vào bình đun sôi. Xoay bình để trộn lượng chứa trong bình.

...

...

...

Tiếp theo, không điều chỉnh thiết bị gia nhiệt. Đảm bảo rằng khi sôi, sự bay hơi diễn ra nhanh và liên tục trong suốt quá trình chuẩn độ, để ngăn ngừa đến mức tối đa sự xâm nhập của không khí vào bình chuẩn độ dẫn đến oxy hóa các chất đựng trong bình.

7.1.5. Đun sôi liên tục lượng chứa trong bình trong 120 s (sử dụng đồng hồ bấm giờ). Thêm 1 ml dung dịch xanh metylen (5.4) vào cuối giai đoạn này. Sau khi kết thúc giai đoạn đun sôi trong 120 s, từ buret thêm 0,5 ml dung dịch D-glucose vào bình cho đến khi xanh metylen mất màu, đun sôi liên tục trong suốt quá trình chuẩn độ.

Ghi lại tổng thể tích dung dịch D-glucose (V ml), là lượng được thêm vào và cả lượng tăng thêm 0,5 ml cuối cùng.

CHÚ THÍCH: Quan sát sự mất màu của xanh metylen tốt nhất bằng cách nhìn vào các lớp phía trên và mặt khum của các lượng chứa trong bình chuẩn độ, vì các lượng này không bị đồng (I) oxit đỏ làm kết tủa. Quan sát sự mất màu dễ dàng hơn khi sử dụng ánh sáng gián tiếp. Dùng một màn chắn màu trắng phía sau bình chuẩn độ để trợ giúp.

7.1.6. Lặp lại 7.1.1 và 7.1.2.

7.1.7. Từ buret cho chảy vào bình đun sôi một lượng dung dịch D-glucose bằng (V- 0.3) ml.

7.1.8. Lặp lại 7.1.4.

7.1.9. Để lượng chứa trong bình sôi liên tục trong 120 s (sử dụng đồng hồ bấm giờ). Thêm 1 ml dung dịch xanh metylen (5.4) vào cuối giai đoạn này. Sau khi kết thúc giai đoạn đun sôi trong 120 s, dùng buret thêm dung dịch D-glucose vào bình, giai đoạn đầu thêm 0,2 ml và cuối cùng thêm từng giọt, cho đến khi mất màu xanh metylen (5.4), giữ sôi liên tục trong suốt quá trình chuẩn độ.

Sau đó, thêm lần lượt các lượng dung dịch D-glucose trong khoảng 10 s đến 15 s. Kết thúc việc bổ sung trong 60 s để tổng thời gian đun sôi không quá 180 s.

...

...

...

7.1.10. Ghi lại thể tích dung dịch D-glucose được sử dụng cho lần chuẩn độ cuối cùng.

7.1.11. Lượng dung dịch D-glucose cần thiết để chuẩn độ vào khoảng 19,0 ml đến 21,0 ml. Nếu nằm ngoài giới hạn này thì điều chỉnh nồng độ dung dịch Fehling A (5.1.1) thích hợp và lặp lại quá trình chuẩn hóa.

7.1.12. Lặp lại 7.1.6 đến 7.1.10 và tính trung bình hai lần chuẩn độ (V₁ ml).

7.1.13. Đối với việc chuẩn hóa hàng ngày dung dịch Fehling hỗn hợp, khi V₁ được biết chính xác, nên chỉ cần chuẩn độ một lần, sử dụng (V₁ - 0,5) ml dung dịch D-glucose bổ sung ban đầu.

CHÚ THÍCH: Mỗi người thao tác cần thực hiện việc hiệu chuẩn phương pháp chuẩn độ và sử dụng giá trị V₁ của mình trong tính toán (8.1.1).

7.2. Phép xác định

7.2.1. Chuẩn bị mẫu thử

Nếu mẫu thử ở dạng bột hoặc dạng tinh thể thì lấy mẫu ra khỏi vật chứa, làm vỡ các cục vón, trộn bằng phương pháp thích hợp và đặt mẫu vào trong vật chứa kín khí thích hợp.

Nếu mẫu ở dạng rắn, thô, ví dụ: đường bột (glucose dạng rắn), thì làm tan chảy mẫu trong vật chứa kín ngâm trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 60 °C đến 70 °C, để nguội đến nhiệt độ môi trường xung quanh và lắc một vài lần mà không tháo nắp để trộn lẫn hơi nước đọng lại bên trong vào mẫu.

...

...

...

7.2.2. Nếu không biết hàm lượng đường khử của mẫu thì lấy một lượng xấp xỉ giá trị của lần chuẩn độ trước, thường được quy định trong 7.1.1 đến 7.1.5, nhưng có điều chỉnh như sau

a) Thêm 10 ml dung dịch mẫu thử thay vì thêm dung dịch D-glucose trong 7.1.3.

b) Sau khi thực hiện theo 7.1.4

1) Ngay sau khi bắt đầu đun sôi, thêm 1 ml dung dịch xanh metylen và từ buret bắt đầu thêm các lượng 1,0 ml dung dịch mẫu thử vào bình trong khoảng 10 s cho đến khi mất màu xanh metylen. Nếu màu xanh mất màu trước khi thêm 1,0 ml dung dịch mẫu thử thì giảm nồng độ của dung dịch mẫu thử và lặp lại quy trình chuẩn độ.

2) Ghi lại tổng thể tích của dung dịch thử được thêm vào (V’ ml) và bao gồm cả phần thêm lần cuối cùng.

V' không được lớn hơn 50 ml. Nếu lớn hơn, tăng nồng độ của dung dịch thử và lặp lại quy trình chuẩn độ.

3) Khả năng khử (xem 3.1) gần đúng (ARP) của mẫu thử tính bằng công thức:

Trong đó:

...

...

...

m₀ là khối lượng của phần mẫu thử trong 500 ml dung dịch mẫu thử, tính bằng gam (g)

Khối lượng của phần mẫu thử cần lấy, tính bằng gam (g), như sau:

7.2.3. Phần mẫu thử

Cân khối lượng của phần mẫu thử (m g), chứa khoảng 2,85 g đến 3,15 g đường khử (biểu thị theo D- glucose khan), chính xác đến 1 mg.

7.2.4. Dung dịch thử

Hòa tan phần mẫu thử (7.2.3) trong nước, chuyển định lượng dung dịch vào bình định mức một vạch 500 ml (6.4), pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.

7.2.5. Chuẩn độ

7.2.5.1. Lặp lại 7.1.1 đến 7.1.9 sử dụng dung dịch mẫu thử (7.2.4) thay cho dung dịch D-glucose (5.3).

...

...

...

7.2.5.3. Thể tích (V₂) của dung dịch mẫu thử (7.2.4) cần thiết trong khoảng 19,0 ml đến 21,0 ml. Nếu V₂ nằm ngoài giới hạn này thì điều chỉnh nồng độ dung dịch thử thích hợp và lặp lại 7.2.5.1 và 7.2.5.2.

7.2.5.4. Thực hiện hai phép xác định trên cùng một mẫu thử.

7.3. Hàm lượng chất khô

Xác định hàm lượng chất khô [DMC % (phần khối lượng)] của mẫu thử như sau:

a) Đối với syro glucose khô, xác định bằng phương pháp quy định trong TCVN 10374 (ISO 1742).

b) Đối với dextrose (khan và ngậm một phân tử nước), xác định bằng phương pháp quy định trong TCVN 10373 (ISO 1741).

c) Đối với syro glucose, xác định bằng phương pháp quy định trong TCVN 10375 (ISO 1743).

8. Biểu thị kết quả

8.1. Phương pháp tính và công thức

...

...

...

8.1.2. Đương lượng dextrose (Lane và Eynon) (xem 3.2)

Trong đó:

V₁ là thể tích của dung dịch D-glucose (5.3) được sử dụng trong quá trình chuẩn hóa dung dịch Fehling hỗn hợp (7.1), tính bằng mililit (ml);

V₂ là thể tích của dung dịch mẫu thử (7.2.4) được sử dụng trong phép xác định (7.2.5), tính bằng mililit (ml);

m là khối lượng phần mẫu thử (7.2.3) được sử dụng để chuẩn bị dung dịch mẫu thử trong bình định mức một vạch 500 ml, tính bằng gam (g) (xem 7.2.4);

DMC là hàm lượng chất khô của mẫu thử, biểu thị bằng phần trăm khối lượng (xem 7.3).

8.1.3. Báo cáo kết quả là trung bình cộng của hai phép xác định và đáp ứng được các yêu cầu về độ lặp lại (xem 8.2).

...

...

...

Kết quả của hai phép xác định nhanh liên tiếp do một người thực hiện không chênh lệch quá 0,75 % giá trị trung bình cộng.

8.3. Độ tái lặp

Các kết quả được báo cáo của hai phòng thử nghiệm khác nhau trên cùng một mẫu thử không chênh lệch quá 1,5 % giá trị trung bình cộng.

9. Báo cáo thử nghiệm

Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ về mẫu thử, ngày thử nghiệm, phương pháp thử đã sử dụng, các kết quả thử nghiệm thu được, mọi điều kiện thao tác không quy định trong tiêu chuẩn này hoặc được xem là tùy chọn, cùng với mọi tình huống bất thường có thể ảnh hưởng đến kết quả.

PHỤ LỤC A

(Tham khảo)

Phương pháp kiểm tra D-glucose khan so sánh chuẩn về sự phù hợp với các yêu cầu trong 5.2 c)

...

...

...

Tách maltose và các loại đường khối lượng phân tử tương đối lớn ra khỏi mẫu D-glucose khan đã biết khối lượng bằng sắc ký giấy. Phát hiện các loại đường tách được theo các chấm màu bằng cách nhúng giấy sắc ký đã khai triển vào dung dịch thuốc thử tạo màu và gia nhiệt.

Kiểm tra xác nhận rằng hàm lượng maltose (dạng khan) không quá 0,10% (khối lượng) bằng cách dùng mắt thường so sánh cường độ màu của chấm maltose với cường độ màu của chấm dextrose và chấm maltose chuẩn. Kiểm tra bằng mắt thường về sự có mặt các chấm đường khác với D-glucose và dextrose.

CHÚ THÍCH: Maltose và isomaltose không tách được bằng phương pháp này; do đó "maltose" cần được hiểu là "maltose và/hoặc isomallose".

A.2. Thuốc thử

Trong quá trình phân tích, chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích và nước cất hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.

A.2.1. Giấy sắc ký: cenllulose bông tinh khiết, 185 g/m², có hàm lượng α-cenllulose lớn hơn 97% (khối lượng) và tro ít hơn 0,06 % (khối lượng), cả hai được tính theo chất khô và chiều rộng tối thiểu 140 mm x chiều dài tối thiểu 420 mm theo hướng chạy của dung môi.

CHÚ THÍCH: Giấy sắc ký Whatman số 3 là thích hợp.

A.2.2. Dung môi khai triển

n-propanol

...

...

...

Etyl axetat

1 phần thể tích

Nước

2 phần thể tích

Chuẩn bị dung môi này ngay trong ngày sử dụng.

A.2.3. Thuốc thử màu

Diphenylamin

1 g

Anilin

...

...

...

Axeton

100 ml

Axit orthophosphoric (H₃PO₄) 88 % (khối lượng)

6 ml

Hòa tan diphenylamin và anilin trong axeton, thêm axit orthophosphoric và trộn.

Chuẩn bị dung môi này ngay trong ngày sử dụng.

A.2.4. Maltose hydrat

10 μl dung dịch chứa 20 g/l maltose khan không được cho thấy chấm nào khác với maltose khi được xử lý theo quy định trong A.4.4, A.4.5, và A.4.6.

Các đường khác maltose có mặt không được quá 1,0 % (khối lượng) (theo maltose khan) (xem A 5.3).

...

...

...

Cân 0,526 g maltose hydrat (A.2.4) tương đương với 0,500 g maltose khan, chính xác đến 1 mg, hòa tan trong nước, chuyển định lượng dung dịch này vào bình định mức một vạch 100 ml (A.3 1), pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.

1 ml dung dịch chuẩn này chứa 0,005 g maltose khan.

Chuẩn bị dung dịch này ngay trong ngày sử dụng.

A.2.6. Maltose, dung dịch chuẩn tương ứng với 0,5 g maltose khan trên lít.

Dùng pipet (A.3.2) chuyển 10,0 ml dung dịch maltose chuẩn (A.2.5) vào bình định mức một vạch 100 ml (A.3.1), pha loãng bằng nước đến vạch và trộn.

1 ml dung dịch chuẩn này chứa 0,5 mg maltose khan.

Chuẩn bị dung dịch này ngay trong ngày sử dụng.

A.3. Thiết bị, dụng cụ

A.3.1. Bình định mức một vạch, dung tích 100 ml, phù hợp với loại B, trong TCVN 7153 (ISO 1042).

...

...

...

A.3.3. Micropipet, có thể phân phối được 10 μl

A.3.4. Máy sấy tóc hoặc nguồn khí ấm thích hợp khác ở nhiệt độ không lớn hơn 40 °C.

A.3.5. Bể sắc ký, để khai triển sắc ký.

A.3.6. Máng, thích hợp để ngâm giấy sắc ký (A.4.6.1) trong thuốc thử màu (A.2.3).

A.3.7. Tủ sấy không khí nóng tuần hoàn cưỡng bức, có kích cỡ thích hợp để làm nóng giấy sắc ký (A.4.6.3) và có thể kiểm soát ở nhiệt độ 80 °C ± 1 °C.

A.4. Cách tiến hành

A.4.1. Mẫu thử

Trộn kỹ mẫu thử.

A.4.2. Dung dịch mẫu thử

...

...

...

A.4.3. Chuẩn bị giấy sắc ký

A.4.3.1. Dùng bút chì vẽ trên giấy sắc ký (A.2.1) một đường thẳng song song và cách mép bên 140 mm, cách mép dưới 80 mm.

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng khoảng cách thay đổi 80 mm để phù hợp với bể sắc ký (A.3.5).

A.4.3.2. Đánh dấu bằng bút chì trên đường thẳng năm chấm gốc A, B, C, D và E, cách nhau 20 mm, bắt đầu 30 mm tính từ cạnh 420 mm.

A.4.4. Sử dụng dung dịch maltose chuẩn và dung dịch thử

A.4.4.1. Ở từng chấm gốc B và D (A.4.3.2) dùng micropipet (A.3.3) chấm hai lần mỗi lần 10 μl dung dịch thử (A.4.2) (chứa 5 000 μg D-glucose khan), sấy khô các chấm bằng dòng không khí ấm (xem A.3.4) ngay sau mỗi lần chấm dung dịch.

A.4.4.2. Ở từng điểm gốc A, C và E dùng micropipet (A.3.3) chấm 10 μl dung dịch maltose chuẩn (A.2.6) (chứa 5 μg maltose khan), sấy khô các chấm bằng dòng không khí ấm ngay sau khi chấm dung dịch.

A.4.5. Khai triển sắc ký

A.4.5.1. Đặt giấy đã chấm dung dịch (A.4.4) vào bể sắc ký đã cân bằng (A.3.5) chứa dung môi khai triển (A.2.2).

...

...

...

A.4.5.2. Cho khai triển sắc ký trong 8 h. Thời gian này là thích hợp ở nhiệt độ 20 °C nhưng có thể giảm nếu nhiệt độ cao hơn đáng kể. Điều quan trọng là tâm của chấm D-glucose (xem A 4.6) dịch chuyển được ít nhất 50 mm ra khỏi gốc nhưng không được chạy khỏi giấy sắc ký.

A.4.5.3. Lấy giấy ra khỏi bể sắc ký và sấy khô bằng dòng không khí ấm.

CHÚ THÍCH: Giấy này có thể được làm khô trong tủ sấy thích hợp duy trì nhiệt độ không lớn hơn 40 °C.

A.4.6. Phát hiện các chấm của đường

A.4.6.1. Cho giấy sắc ký khai triển đã khô (A.4.5.3) ở tốc độ không đổi đi qua máng (A.3.6) có chứa thuốc thử màu (A.2.3).

A.4.6.2. Để ráo giấy sắc ký và sấy khô dưới dòng không khí ấm (xem A.3.4) hoặc trong tủ sấy thích hợp (xem Chú thích trong A.4.5.3).

A.4.6.3. Đặt giấy sắc ký khô (A.4.6.2) vào tủ sấy bằng không khí nóng tuần hoàn cưỡng bức (A.3.7).

A.4.6.4. Cứ sau 5 min kiểm tra giấy sắc ký. Lấy giấy sắc ký ra khỏi tủ sấy khi các chấm màu đã hiện rõ nhưng toàn bộ giấy sắc ký chưa bị nhuộm màu.

A.4.7. Kiểm tra sắc ký đồ

...

...

...

A.4.7.2. Quan sát để kiểm tra sắc ký đồ để chỉ ra các loại đường khác với D-glucose và maltose từ các chấm gốc B và D.

A.5. Đánh giá kết quả

A.5.1. Nếu các chấm maltose từ các chấm gốc B và D (A.4.4.1) có cường độ màu nhỏ hơn cường độ màu của các chấm maltose từ các chấm gốc A, C và E (A.4.4.2) thì hàm lượng maltose (ví dụ maltose khan) của mẫu D-glucose khan không lớn hơn 0,1 % (khối lượng).

A.5.2. Nếu chỉ có các chấm màu từ các chấm gốc B và D (A.4.4.1) là của D-glucose và maltose và phần còn lại của giấy sắc ký là không màu, thì mẫu D-glucose khan đáp ứng yêu cầu về sự không có mặt các loại đường có khối lượng phân tử tương đối lớn hơn so với phân tử lượng của maltose.

A.6. Độ nhạy của phương pháp

Khối lượng maltose khan nhỏ nhất cho chấm màu có thể nhìn thấy là 2 μg.

1) TCVN 7149:2007 (ISO 385:2005) Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Buret thay thế hai tiêu chuẩn đã hủy TCVN 7149-1 (ISO 385-1), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Buret - Phần 1: Yêu cầu chung và TCVN 7149-2 (ISO 385-2). Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Buret - Phần 2: Buret không quy định thời gian chờ.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10376:2014 (ISO 5377:1981) về Sản phẩm thủy phân từ tinh bột - Xác định khả năng khử và đương lượng dextrose - Phương pháp chuẩn độ hằng số Lane và Eynon