CHÚ THÍCH: E₁, E₂ và E₃ có thể là ba rennet khác nhau hoặc là một rennet ở ba độ pha loãng khác nhau, nghĩa là không pha loãng, pha loãng 20 lần và pha loãng 100 lần, tương ứng.

Hình A.1 — Ví dụ về thiết lập phiến kính

A.5.3.2. Rửa và nhuộm màu các phiến đồ

Mỗi phiến đồ được phủ một lớp giấy lọc và vài lớp (ví dụ 0,5 cm) giấy mềm hấp thụ trước đó đã được nén nhẹ (ví dụ: sử dụng để dưới chồng sách) cho tối thiểu 10 min. Bỏ giấy ra. Ngâm phiến đồ này trong dung dịch natri clorua 9 g/l (A.5.1.1) hơn 1 h. Lặp lại quy trình nén trong 10 min. Rửa phiến đồ này trong dung dịch natri clorua 9 g/l qua đêm ở nhiệt độ phòng.

Nén phiến đồ đã chuẩn bị và ngâm trong nước cất trong 30 min. Lấy ra và nén rồi làm khô phiến đồ này trong không khí nóng.

Các lỗ gel trống được đổ đầy bằng nước cất để ngăn ngừa gel nứt trong khi nén. Tháo bỏ giấy lọc ra khỏi gel sau mỗi lần nén. Quy trình rửa có thể được sửa đổi bằng cách sử dụng thời gian dài hơn và có nén hoặc không nén gel hoặc rút ngắn thời gian rửa và nén gel thường xuyên hơn (xem thêm hướng dẫn của nhà cung cấp).

Ngâm phiến đồ đã chuẩn bị trong thuốc nhuộm (A.5.3.1) trên 15 min.

Làm mất màu phiến đồ trong dung môi của etanol, axit axetic và nước với các thể tích tương ứng 4,5 + 1,0 + 4,5 được sử dụng để chuẩn bị thuốc nhuộm (A.5.3.1). Sau khi làm mất màu, phiến đồ có thể được rửa sạch trong nước và sấy khô trong không khí nóng.

A.6. Diễn giải kết quả

...

...

...

Sự xuất hiện đường kết tủa, giữa giếng chứa các kháng thể với enzym A và giếng chứa mẫu để phân tích E, cho thấy sự có mặt của enzym A trong mẫu E. Kết tủa này cần tiếp tục xuất hiện giữa đường kết tủa đối với enzym đối chứng và đường kết tủa đối với mẫu thử nghiệm (xem Hình A.2).

Hình A.2 - Ví dụ về các kết quả khuếch tán kép

Giải thích kết quả của phiến đồ như sau:

- Kết tủa giữa mỗi kháng huyết thanh và mẫu đối chứng tương ứng (xem A.5.2.2) cho thấy các hàm số thử nghiệm.

- Mẫu E₁ chứa chymosin (CH), pepsin bò (BpA) và Rhizomucor miehei protease (Rmp).

- Mẫu E₂ chỉ chứa Rhizomucor miehei protease (Rmp).

- Không có mẫu nào chứa pepsin lợn (PPA).

- Không có mẫu E₃ trên phiến kính này.

...

...

...

Độ nhạy của phương pháp thay đổi với các kháng huyết thanh được sử dụng, nhưng trong rennet chứa 200 IMCU/ml có mặt enzym tương ứng nhỏ hơn 5 % tổng số hoạt độ có thể dễ dàng phát hiện được trong hỗn hợp. Nói chung, giá trị ngưỡng 1 % của tổng số hoạt độ có thể đạt được.

PHỤ LỤC B

(Tham khảo)

KẾT QUẢ CỦA PHÉP THỬ LIÊN PHÒNG THỬ NGHIỆM

B.1. Yêu cầu chung

Phép thử liên phòng thử nghiệm này gồm có 10 phòng thử nghiệm của sáu quốc gia tham gia, thực hiện trên các mẫu rennet bò. Phép thử liên phòng thử nghiệm này do A. Andrén (SE) tổ chức năm 1995, các thành viên tham gia bao gồm: C. Repelius (NL), J.-C. Collin (FR), T. Sørhaug (NO), J.A. Jans (NL), M. Rampilli (IT), M. Harboe (DK), A. van Boven (NL), M. Stolz (FR), P. Molinari (IT) và A.-K. Levin (SE). Các kết quả thử nghiệm đã được phân tích thống kê theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1)^[3] và TCVN 6910-2 (ISO 5725-2)[4].

B.2. Mẫu thử và kết quả

Nghiên cứu này được thực hiện sử dụng bốn mẻ khác nhau của rennet bò dạng lỏng, bao trùm các tỷ lệ hoạt độ chymosin thấp, trung bình và cao; các mức chymosin và pepsin tương ứng khác nhau. Bốn mẻ được chia thành tám mẫu mù kép (1/4, 2/3, 5/7 và 6/8).

...

...

...

Bảng B.1 - Đánh giá thống kê tỷ lệ hoạt độ chymosin, tính bằng phần trăm từ 10 phòng thử nghiệm

Mẫu

Trung bình %

S_r

C_v,r %

r

r_rel, %

S_R

CV,R %

...

...

...

R_rel%

Ngoại lệ

1/4

90,40

0,69

0,76

1,93

2,13

0,73

...

...

...

2,05

2,27

0

2/3

54,36

0,69

1,28

1,94

3,57

...

...

...

2,46

3,75

6,89

0

5/7

20,33

0,28

1,40

0,79

...

...

...

1,16

5,69

3,24

15,92

1 Corchan

6/8

72,55

0,94

1,29

...

...

...

3,61

1,41

1,94

3,94

5,43

1 Grubbs

Trung bình

-

0,65

...

...

...

1,82

3,31

1,16

2,72

3,24

7,63

-

Bảng B.2 - Đánh giá thống kê hàm lượng chymosin, tính bằng miligam trên lít, thu được từ 10 phòng thử nghiệm

Mẫu

...

...

...

S_r

C_v,r %

r

R_rel, %

S_R

CV,R %

R

R_rel%

Ngoại lệ

...

...

...

599,00

24,11

4,02

67,50

11,27

40,93

6,83

114,59

19,13

...

...

...

2/3

456,15

12,73

2,79

35,64

7,81

29,47

6,46

82,51

...

...

...

0

5/7

216,94

7,68

3,54

21,50

9,91

16,92

7,80

...

...

...

21,83

1 Corchan

6/8

513,78

21,47

4,18

60,10

11,70

32,60

...

...

...

91,29

17,77

1 Grubbs

Trung bình

-

16,50

3,63

46,19

10,17

...

...

...

6,86

83,94

19,20

-

Bảng B.3 - Đánh giá thống kê hàm lượng pepsin, tính bằng milligam trên lit, thu được từ 10 phòng thử nghiệm

Mẫu

Trung bình mg/l

S_r

C_v,r %

...

...

...

R_rel, %

S_R

CV,R %

R

R_rel%

Ngoại lệ

1/4

193,65

16,22

...

...

...

45,43

23,46

19,40

10,02

54,33

28,06

0

2/3

1 169,90

...

...

...

3,76

123,15

10,53

107,72

9,21

301,63

25,78

0

5/7

...

...

...

366,60

13,75

1 026,47

38,50

468,92

17,59

1 312,98

49,25

0

...

...

...

612,35

47,53

7,76

133,09

21,73

68,49

11,18

191,77

31,32

...

...

...

Trung bình

-

118,58

8,41

332,03

23,56

166,13

12,00

465,18

...

...

...

-

THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa và sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu

[2] TCVN 7153 (ISO 1042), Dụng cụ thí nghiệm bằng thủy tinh - Bình định mức

[3] TCVN 6910-1 (ISO 5725-1), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 1: Nguyên tắc và định nghĩa chung

[4] TCVN 6910-2 (ISO 5725-2), Độ chính xác (độ đúng và độ chụm) của phương pháp đo và kết quả đo - Phần 2: Phương pháp cơ bản xác định độ lặp lại và độ tái lập của phương pháp đo tiêu chuẩn

[5] ANDRÉN, A., Rennets and coagulants. In: FUQUAY, J.W., FOX, P.F., MCSWEENEY, P. editors. Encyclopedia of dairy sciences, 2nd edition, pp. 574.-578. Elsevier, 2011

[6] HARBOE, M., BROE, M.L., QVIST, K.B. The production, action and application of rennet and coagulants. In: LAW, B.A., TAMINE, A.Y., editors. Technology of cheesemaking, second edition, pp. 98.-129. Oxford: Wiley .-Blackwell, 2010

...

...

...

[8] GARNOT, P., THAPON, J.L., MATHIEU, C.M., MAUBOIS, J.L., RIBADEAU-DUMAS, B. Determination of rennin and bovine pepsins in commercial rennets and abomasal juices. J. Dairy Sci. 1972,55, pp. 1641.-1650.

[9] COLLIN, J.C., MARTIN, P., GARNOT, P., RIBADEAU-DUMAS, B., MOCQUOT, G. Determination of chymosin and bovine pepsin A in commercial bovine rennets and pepsins. Milchwissenschaft 1981, 36, pp. 32.-35.

[10] COLLIN, J.C., MUSET DE RETTA, G., MARTIN, P. Immunological identification of milk-clotting enzymes. J. Dairy Res. 1982, 49, pp. 221.-230.

[11] International Collaborative study on Calf Rennet and Adult Bovine Rennet. - Determination of Chymosin and Bovine Pepsin Contents . - Bull. IDF (in press).

[1] Fractogel^® EMD DEAE (M) là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

[2] Cột được nhồi trước Mono Q^® 1 ml là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

[3] Union Carbide là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

[4] Bio-Rad-Econopac 10DC là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

[5] FPLC^® là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

...

...

...

[7] Cecalait, rue de Versailes, BP.70129, 39808 POLIGNY Pháp (email: secretariat@cecalait.fr) là ví dụ về sản phẩm phù hợp bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

[8] ISO 5725:1986 đến nay đã hủy và được thay thế bằng ISO 5725-1 (được chấp nhận thành TCVN 6910-1)^[3] và ISO 5725-2 (được chấp nhận thành TCVN 6910-2)^[4]

[9] "Gelbond" là ví dụ về sản phẩm phù hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra thuận tiện cho việc sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

[10] Indubiose A37 là ví dụ về sản phẩm phù hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra rạo thuận tiện cho việc sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

[11] INRA, du champ de Foire, 39800 Poligny, France and Chr. Hansen A/S, 1-27 Jernholmen, 2650 HVIDOVRE Denmark (Fax +45 36 86 77 76) là tổ chức cung cấp sản phẩm này.

[12] Thuốc nhuộm R-250 hoặc Blue Serva là ví dụ về sản phẩm phù hợp có bán sẵn. Thông tin này đưa ra tạo thuận tiện cho việc sử dụng tiêu chuẩn và không ấn định phải sử dụng chúng.

Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 10021:2013 (ISO 15163:2012) về Sữa và sản phẩm sữa – Rennet bê và rennet bò – Xác định hàm lượng chymosin và pepsin bò bằng phương pháp sắc ký