PHỤ LỤC 2

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI ACESULFAM KALI

Acesulfame potassium; Acesulfame K;

INS 950

ADI = 0 - 15 mg/kg thể trọng

Muối kali của 6-methyl-1,2,3-oxathiazin-4(3H)-1-2,2-dioxid; muối kali của 3,4-dihydro-6-methyl-1,2,3-oxathiazin-4-on-2,2-dioxid

55589-62-3

...

...

...

201,24

Bột kết tinh trắng, không mùi

Chất ngọt tổng hợp, chất điều hương

Dễ tan trong nước, rất ít tan trong cồn.

Hòa tan 10 mg chế phẩm thử trong 1000 ml nước. Dung dịch này có cực đại hấp thụ tại 227 ± 2 nm

Phải có phản ứng đặc trưng của kali.

(Tiến hành thử với cắn thu được khi đốt 2 g mẫu thử).

...

...

...

Không được quá 1,0% (105 ^oC; 2 giờ).

5,5 – 7,5 (dung dịch 1%).

Đạt đối với 20 mg/kg thành phần đáp ứng với UV.

Xem mô tả trong phần phương pháp thử

Không được quá 3 mg/kg.

(Phương pháp III; sử dụng cỡ mẫu thử thích hợp và thể tích dung dịch chuẩn phù hợp để thiết lập đường chuẩn)

Không được quá 1 mg/kg.

Không được nhỏ hơn 99,0% và không lớn hơn 101,0% tính theo chế phẩm đã làm khô.

...

...

...

Tiến hành theo chỉ dẫn trong phần phương pháp sắc ký (Sắc ký lỏng hiệu năng cao, FNP 5) theo điều kiện sau và sử dụng acid 4-hydroxybenzoic ethyl ester làm chất đối chiếu:

Cột: thép không gỉ 25 cm ´ 4,6 mm

Pha tĩnh: Pha ngược (C18 silica gel, 3 - 5 µm)

Rửa giải: Đẳng dòng

Pha động: Acetonitril/ tetrabutyl amoni hydrosulfat (TBAHS) 0,01 mol/L trong nước (40:60)

Tốc độ dòng: Khoảng 1 ml/phút

Detector: UV hoặc Diod array, 227 nm

Thể tích tiêm: 20 µl dung dịch chế phẩm thử 10 g/L trong nước khử ion

...

...

...

Nếu pic khác ngoài kali acesulfam xuất hiện trong khoảng 3 lần thời gian rửa giải của kali acesulfam, tiến hành phân tích lần thứ hai với 20 µl dung dịch chế phẩm thử 0,2 mg/L.

Tổng diện tích tất cả các pic được rửa giải trong lần phân tích thứ nhất với thời gian chạy gấp 3 lần thời gian rửa giải của kali acesulfam, trừ pic của kali acesulfam không được lớn hơn diện tích pic của kali acesulfam trong lần phân tích thứ hai.

Thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4 . Sử dụng kỹ thuật hấp thụ nguyên tử thích hợp để xác định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

Cân khoảng 0,15 g (chính xác đến mg) mẫu thử khô, hòa tan trong 50,0 ml acid acetic băng (quá trình hòa tan có thể chậm) và chuẩn độ bằng acid percloric 0,1 N, xác định điểm kết thúc chuẩn độ bằng đo thế hoặc sử dụng chỉ thị là hai giọt dung dịch tím tinh thể (TS) và chuẩn độ bằng acid percloric 0,1 N tới khi chuyển sang màu lam lục bền trong ít nhất 30 giây. Tiến hành làm một mẫu trắng song song và hiệu chỉnh nếu cần.

Mỗi ml acid percloric 0,1 N tương đương với 20,12 mg C₄H₄KNO₄S.

PHỤ LỤC 3

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI ISOMALT

Isomaltulose hydro hóa

...

...

...

ADI “Không xác định”

Là hỗn hợp của các mono và disaccharid hydro hóa mà thành phần chính là các disaccharid sau:

6-O-a-D-Glucopyranosyl-D-sorbitol (1,6-GPS) và

1-O-a-D-Glucopyranosyl-D-mannitol dihydrat (1,1-GPM)

64519-82-0

6-O-a-D-Glucopyranosyl-D-sorbitol: C₁₂H₂₄O₁₁

1-O-a-D-Glucopyranosyl-D-mannitol dihydrat: C₁₂H₂₄O₁₁.H₂O

...

...

...

1,1-GPM (không có nước trong tinh thể)

6-O-a-D-Glucopyranosyl-D-sorbitol: 344,32

1-O-a-D-Glucopyranosyl-D-mannitol dihydrat: 380,32

Tinh thể trắng hoặc không màu, hút ẩm nhẹ.

Chất ngọt tổng hợp, chất độn, chất chống đông vón, chất làm bóng.

Dễ tan trong nước, rất ít tan trong cồn.

Đạt yêu cầu (mô tả trong phần Phương pháp thử).

...

...

...

Không được quá 0,05%. (Cân 5 g mẫu thử).

Không được quá 3%.

Không được quá 6%.

Không được quá 0,3%.

Không được quá 2 mg/kg.

Không được quá 1 mg/kg.

Không được nhỏ hơn 98% mono- và disaccarid hydro hóa và không nhỏ hơn 86% hỗn hợp của 6-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-sorbitol và 1-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-manitol tính theo chế phẩm khan.

...

...

...

Bản mỏng sắc ký là bản nhôm hoặc kính dài ~ 12 cm phủ lớp pha tĩnh là Kieselgel 60 F₂₅₄, (Art. 5554, Merck hoặc tương đương) dày ~ 0,2 mm.

Dung dịch chuẩn:

Hòa tan 500 mg mỗi loại đường sau đây trong 100 ml nước: Sorbitol, manitol, lactilol, 6-O-a-D-Glucopyranosyl-D-sorbitol (1,6 GPS), 1-O-a-D-Glucopyranosyl-D-manitol (1,1 GPM)

Dung dịch thử:

Hoà tan 500 mg mẫu trong 100 ml nước.

Dung môi A:

Isopropanol/n-butanol/dung dịch acid boric (25 mg/ml)/acid acetic/acid propionic (50/30/20/2/16 - tt/tt/tt/tt/tt).

Dung môi B:

Ethyl acetat/pyridin/nước/acid : acid acetic : acid propionic (50/50/10/5/5 - tt/tt/tt/tt/tt).

...

...

...

Số I: Dung dịch natri metaperiodat 0,1% (kl/kl).

Số II: ethanol/acid sulfuric/anisaldehyd/acid acetic (90/5/1/1 - tt/tt/tt/tt).

Tiến hành

Chấm ~ 0,3 mL mỗi dung dịch chuẩn và dung dịch thử lên vạch xuất phát của bản mỏng. Sấy khô vết chấm trong không khí nóng. Tiến hành khai triển sắc ký trong buồng khai triển đã bão hòa hệ dung môi A hoặc B, đến khi chiều cao tuyến dung môi đạt ~ 10 cm. Để bản mỏng khô trong không khí nóng, sau đó ngâm bản mỏng trong dung dịch thuốc thử hiện màu số I trong 3 giây.

 Lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí nóng. Chú ý: bản mỏng phải khô cả 2 mặt. ngâm bản mỏng trong dung dịch thuốc thử hiện màu số II trong 3 giây. Lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí nóng đến khi có thể quan sát được màu của vết. Có thể điều chỉnh độ tương phản với màu nền trong dòng không khí ấm.

Giá trị R_f gần đúng và màu của vết trên bản mỏng đặc trưng riêng cho từng chất như sau:

Hợp chất

màu

R_f (trong DM A)

...

...

...

Mannitol

Hơi đỏ

0,36

0,40

Sorbitol

nâu

0,36

0,36

GPM

...

...

...

0,28

0,16

GPS

Xám-xanh lam

0,25

0,13

Maltitol

Xanh lục

0,26

...

...

...

Lactilol

Xanh olive

0,23

0,14

Giá trị R_f có thể thay đổi chút ít khi sử dụng bản mỏng silicagel từ các nguồn khác nhau.

Vết chính trên sắc ký đồ dung dịch thử isomalt phải tương ứng về R_f và màu sắc của vết GPM và GPS.

Thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4 - Tiến hành theo hướng dẫn trong chuyên luận thử giới hạn các hợp chất khử (tính theo glucose) phương pháp II. Khối lượng đồng (I) oxyd không được quá 50 mg.

Dung dịch thử:

...

...

...

Dung dịch chuẩn:

Chuẩn bị 3 dung dịch chuẩn (theo hướng dẫn chuẩn bị dung dịch thử) nhưng thay vì cho 20,0 g mẫu thử thì cho 0,5 ml; 1,0 ml; 1,5 ml dung dịch chuẩn chứa 10 mg Ni/L.

Tiến hành:

Chỉnh thiết bị về 0 bằng cách đo dung dịch methyl isobutyl keton (được chuẩn bị như chuẩn bị dung dịch thử nhưng không cho mẫu thử). Đo độ hấp thụ của dịch methyl isobutyl keton chiết ra tại 232,0 nm, sử dụng đèn cathod rỗng Nickel làm nguồn bức xạ và ngọn lửa acetylen/không khí.

Thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4 . Sử dụng kỹ thuật hấp thụ nguyên tử thích hợp để xác định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

Dung dịch chuẩn nội

Hòa tan lượng vừa đủ phenyl-b-D-glucopyranosid và manitol trong nước sao cho thu được dung dịch có nồng độ 1 mg phenyl-b-D-glucopyranosid/1g nước và 50 mg mannitol/1 g nước.

Dung dịch chuẩn

Cân chính xác lượng 6-O-a-D-Glucopyranosyl-D-sorbitol (1,6 GPS), 1-O-a-D-Glucopyranosyl-D-manitol (1,1 GPM) tính theo chế phẩm đã làm khô, hoà tan riêng rẽ trong nước thành 2 dung dịch chuẩn có nồng độ 50 mg/g. Đồng thời pha một dung dịch có thành phần gần đúng gồm 1 mg manitol/g và 1 mg sorbitol/g.

...

...

...

Cân khoảng 1 g mẫu thử (chính xác đến mg) hòa tan trong nước vừa đủ để thu được nồng độ khoảng 10 g/100 g.

Tiến hành

Hút 100,0 mg dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử vào các ống nghiệm có nút, thêm vào mỗi ống 100,0 mg dung dịch chuẩn nội. Loại nước bằng cách đông khô và hoà tan phần còn lại trong 1,0 ml pyridin Thêm vào mỗi ống 4 mg O-benzyl-hydroxylamin hydroclorid, đậy nút và để yên tại nhiệt độ phòng trong 12 giờ. Sau đó thêm 1 ml N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamid (MSTFA) và đun nóng tại 80 ^oC trong 12 giờ, trong khi đun thỉnh thoảng lắc, sau đó để nguội. Bơm 1 mL mỗi dung dịch này trực tiếp vào máy sắc ký khí dưới điều kiện hoạt động như sau:

Khí mang He (dòng ban đầu ~ 1 ml/phút tại 80 ^oC và 1 atm, chia dòng 25 ml/phút);

Cột Fused silica HT-8 (25 m x 0,22 mm x 0,25 mm) hoặc tương đương;

Bơm mẫu: chương trình nhiệt độ bay hơi 30 ^oC; 270^o/phút đến 300^o (49 phút);

Detector: ion hóa ngọn lửa FID; 360 ^oC;

Chương trình nhiệt độ: 80^o (3 phút); 10^o/phút đến 210^o; 5^o/phút đến 300^o (6 phút).

Thời gian lưu gần đúng như sau:

...

...

...

Mannitol 19,5 phút

Sorbitol 19,6 phút

Chuẩn nội:

Phenyl-ß-D-glucopyranosid 26,8 phút

Maltitol 33,5 phút

Các disaccharid hydro hóa (32 - 36 phút)

1,1-GPS 33,9 phút

1,1-GPM 34,5 phút

1,6-GPS 34,6 phút

...

...

...

Trong đó

a_I = diện tích pic của cấu tử I (μV·s)

a_S = diện tích pic của chuẩn nội (μV·s)

m_S = Khối lượng của chuẩn nội dùng để dẫn xuất hóa (mg d.s.)

m_ISOMALT = Khối lượng mẫu thử tham gia dẫn xuất hóa (mg d.s.)

F_I = Hệ số tương quan đáp ứng f_I/f_S

f_I = Hệ số đáp ứng của cấu tử I : f_I =(a_I/m_I) x (100/% độ tinh khiết)

f_S = Hệ số đáp ứng của chuẩn nội: f_S =(a_S/m_S) x (100/% độ tinh khiết)

...

...

...

Chú ý: Sử dụng maltitol làm chuẩn nội khi tính hàm lượng các disaccharid hydro hóa (VD 1,1-GPM; 1,6-GPS) và phenyl-b-D-glucopyranosid làm chuẩn nội khi tính hàm lượng các monosaccharid hydro hóa (manitol, sorbitol). Để tính tổng saccharid khác (hydro hóa hoặc không hydro hóa) lấy 100% trừ đi tổng hàm lượng 1,1-GPM; 1,6-GPS; manitol; sorbitol.

PHỤ LỤC 4

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI SACCARIN

INS 954

ADI = 0 - 5 mg/kg thể trọng

1,2-Benzisothiazol-3(2H)-on-1,1-dioxid;

3-oxo-2,3-dihydrobenzo[d]isothiazol-1,1-dioxid

...

...

...

C₇H₅NO₃S

183,18

Tinh thể hoặc bột tinh thể trắng, không mùi hoặc có mùi thơm nhẹ.

Chất ngọt tổng hợp

Ít tan trong nước; tan trong dung dịch kiềm, ít tan trong ethanol.

Dung dịch mẫu thử bão hòa có tính acid.

Đạt yêu cầu (mô tả trong phần Phương pháp thử).

...

...

...

Không được quá 1,0% (105^oC; 2 giờ)

226 - 230^oC.

Không được quá 0,2% (Cân 2 g mẫu thử).

Đạt yêu cầu (mô tả trong phần Phương pháp thử).

Đạt yêu cầu (mô tả trong phần Phương pháp thử).

Không được quá 25 mg/kg.

Không được quá 30 mg/kg.

Không được quá 1 mg/kg.

...

...

...

Hòa tan 0,1 g mẫu thử trong 5 ml natri hydroxyd 5%. Cho bay hơi đến khô và nung nhẹ cắn trên ngọn lửa nhỏ đến khi không còn mùi amoniac thoát ra. Sau khi để nguội, hòa tan cắn trong 20 ml nước, trung hòa dung dịch bằng dung dịch acid hydrocloric loãng (TS) và lọc. Thêm 1 giọt dung dịch sắt (III) clorid (TS) vào dịch lọc, dung dịch có màu tím.

Trộn 20 mg mẫu thử với 40 mg resorcinol, thêm 10 giọt acid sulfuric, đun cách dầu hỗn hợp tại 200 ^oC trong 3 phút, sau khi làm mát, thêm 10 ml nước và lượng dư dung dịch natri hydroxyd (TS). Dung dịch này có huỳnh quang xanh lục.

Thêm nhỏ giọt dụng dịch sắt (III) clorid (TS) vào dung dịch mẫu thử bão hòa. Không được xuất hiện kết tủa màu tím.

Hòa tan 0,2 g mẫu thử trong 5 ml dung dịch acid sulfuric (TS). Giữ tại nhiệt độ 48 - 50^oC trong 10 phút. Màu của dung dịch không được đậm hơn màu vàng nâu nhạt của dung dịch đối chứng A (Matching Fluid A).

Thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4 - Tiến hành theo hướng dẫn trong chuyên luận thử giới hạn selen, phương pháp I, cân 0,2 g mẫu thử.

Thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4 . Sử dụng kỹ thuật hấp thụ nguyên tử thích hợp để xác định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

...

...

...

Mỗi ml natri hydroxyd 0,1 N tương đương với 18,32 mg C₇H₅NO₃S.

PHỤ LỤC 5

YÊU CẦU KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG PHÁP THỬ ĐỐI VỚI SORBITOL

D-Glucitol, D-Sorbitol, Sorbol

INS 420

ADI “không giới hạn”

D-Sorbitol

...

...

...

C₆H₁₄O₆

182,17

Bột trắng háo nước, bột tinh thể, dạng vẩy hoặc hạt

Chất ngọt tổng hợp, chất giữ ẩm, chất tạo kết cấu, chất ổn định, chất độn.

Rất dễ tan trong nước, ít tan trong ethanol.

88 – 102 ^oC.

Đạt yêu cầu (mô tả trong phần Phương pháp thử)

...

...

...

Không được quá 1%. (phương pháp Karl Fisher)

Không được quá 0,1%

Clorid

Không được quá 50 mg/kg

Không được quá 100 mg/kg

Nickel

Không được quá 2 mg/kg

Không được quá 0,3%

Không được quá 1,0% (tính theo glucose)

...

...

...

Không được thấp hơn 97,0% C₆H₁₄O₆ trong tổng các glycitol và không được thấp hơn 91,0% sorbitol tính theo chế phẩm khô. Thuật ngữ glycitol chỉ các hợp chất có công thức CH₂OH-(CHOH)_n-CH₂OH, n £ 4.

Tiến hành theo chỉ dẫn ở phần Sắc kí lớp mỏng của các Polyol tại JECFA monograph 1 - Vol.4.

Sử dụng như sau:

Dung dịch chuẩn

Hòa tan 50 mg sorbitol chuẩn đối chiếu USP trong 20 ml nước

Dung dịch thử

Hòa tan 50 mg mẫu thử trong 20 ml nước

...

...

...

Thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4-Thử trên 10 g mẫu thử bằng Phép thử giới hạn clorid, dùng 1,5 ml acid hydrocloric 0,01 N làm dung dịch đối chứng.

Thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4-Thử trên 10 g mẫu thử bằng Phép thử giới hạn sulfat, dùng 2,0 ml acid sulfuric 0,01 N làm dung dịch đối chứng.

Thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4 - phần Các chất khử (tính theo glucose), Phương pháp II. Khối lượng của đồng (I) oxyd phải không vượt quá 50 mg.

Thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4-Cho 2,1 g mẫu thử vào bình 250 ml lắp khít với một ống nối thủy tinh mài, thêm 40 ml acid hydrocloric 0,1 N, lắp sinh hàn hồi lưu, và đun hồi lưu trong 4 giờ. Chuyển dung dịch này sang cốc 400 ml, rửa sạch bình với khoảng 10 ml nước, trung tính bằng natri hydroxyd 6 N và tiến hành như chỉ dẫn trong phần các chất khử (tính theo glucose), Phương pháp II. Khối lượng của đồng (I) oxyd phải không vượt quá 50 mg.

Thử theo hướng dẫn tại JECFA monograph 1 - Vol.4. Sử dụng kỹ thuật hấp thụ nguyên tử thích hợp cho hàm lượng quy định để xác định. Lựa chọn cỡ mẫu thử và phương pháp chuẩn bị mẫu dựa trên nguyên tắc của phương pháp mô tả trong JECFA monograph 1 - Vol.4 phần các phương pháp phân tích công cụ.

Sử dụng sắc kí lỏng để xác định hàm lượng Sorbitol của mẫu thử (xem JECFA monograph 1 - Vol.4)

Thiết bị

Sắc kí lỏng (HPLC)

Phát hiện: detector đo độ khúc xạ duy trì ở nhiệt độ không đổi

...

...

...

Cột: AMINEX HPX 87 C (nhựa ở dạng calci), dài 30 cm, đường kính trong 9 mm

Dung môi rửa giải: nước cất hai lần được loại khí (lọc qua màng lọc Millipore 0,45 µm)

Điều kiện sắc kí

Nhiệt độ cột: 85±0,5^oC

Lưu lượng dòng: 0,5 ml /phút

Dung dịch chuẩn

Hòa tan một lượng cân chính xác Sorbitol chuẩn đối chiếu trong nước để thu được dung dịch có nồng độ khoảng 10,0 mg/ml.

Dung dịch thử

Cho khoảng 1 g mẫu thử cân chính xác vào bình định mức 50 ml, pha loãng bằng nước đến vạch và lắc đều.

...

...

...

Tiêm riêng biệt cùng thể tích (khoảng 20 µL) dung dịch thử và dung dịch chuẩn vào hệ thống sắc kí. Ghi sắc đồ và đo đáp ứng của pic Sorbitol. Tính khối lượng (mg) của Sorbitol trong phần mẫu thử đã lấy định lượng theo công thức sau:

Trong đó:

C = nồng độ, mg/ml, Sorbitol trong dung dịch chuẩn

A_t = đáp ứng của pic Sorbitol của dung dịch thử

A_c = đáp ứng của pic Sorbitol của dung dịch chuẩn.

ANNEX 2

SPECIFICATIONS AND TESTS FOR ACESULFAME POTASSIUM

Acesulfame potassium; Acesulfame K;

INS 950

ADI = 0 - 15 mg/kg bw

Potassium salt of 6-methyl-1,2,3-oxathiazine-4(3H)-one-2,2-dioxide; potassium salt of 3,4-dihydro-6-methyl-1,2,3-oxathiazine-4-one-2,2-dioxide

55589-62-3

...

...

...

201,24

 Odourless, white crystalline powder

Sweetener, flavour enhancer

Freely soluble in water, very slightly soluble in ethanol.

Dissolve 10 mg of the sample in 1,000 ml of water. The solution shows an absorbance maximum at 227±2 nm

Passes test.

(Test the residue obtained by igniting 2 g of the sample).

...

...

...

Not more than 1.0% (105^oC, 2 h).

5.5 - 7.5 (1% soln).

Passes test for 20 mg/kg of UV active components.

See description under Tests.

Not more than 3 mg/kg.

(Method III; using an appropriate sample size and appropriate volumes of the standard solution for construction of the calibration curve)

Not more than 1 mg/kg.

Not less than 99.0% and not more than 101.0% on the dried basis.

...

...

...

Proceed as directed under the method for Chromatography (High Performance Liquid Chromatography, FNP 5) using the following conditions and using 4-hydroxybenzoic acid ethyl ester as the reference substance:

Column: 25 cm x 4.6 mm stainless steel

Stationary phase: Reversed phase (C18 silica gel, 3 - 5 µm)

Elution: Isocratic

Mobile phase: Acetonitrile/0.01 mol/l tetrabutyl ammonium hydrogen sulfate (TBAHS) in water; 40/60 v/v

Flow: About 1 ml/min

Detector type: UV or Diode array, 227 nm

Sample size: 20 µl of a 10 g/l solution of the sample in deionized water

...

...

...

If peaks other than that due to acesulfame K appear within three times the elution time of acesulfame K, carry out a second run using 20 µl of a 0.2 mg/l solution of the sample.

The sum of the areas of all peaks eluted in the first run within 3 times the elution time of acesulfame K elution time, except for the acesulfame K peak, does not exceed the peak area of acesulfame K in the second run.

Tested under JECFA monograph 1 - Vol.4. Determine using an atomic absorption technique appropriate to the specified level.The selection of sample size and method of sample preparation may be based on the principles of the method described in JECFA monograph 1 - Vol.4 “Instrumental Methods.”

Dissolve about 0.15 g of the dried sample (dissolution may be slow), accurately weighed, in 50.0 ml glacial acetic acid and titrate potentiometrically with 0.1 N perchloric acid, or add two drops of crystal violet TS and titrate with 0.1 N perchloric acid, to a blue-green end-point which persists for at least 30 sec. Perform a blank determination and make any necessary correction.

Each ml of 0.1 N perchloric acid is equivalent to 20.12 mg of C₄H₄KNO₄S.

ANNEX 3

SPECIFICATIONS AND TESTS FOR ISOMALT

Hydrogenated isomaltulose

...

...

...

ADI “Not limited”

A mixture of hydrogenated mono- and disaccharides whose principal components are the disaccharides:

6-O-a-D-Glucopyranosyl-D-sorbitol (1,6-GPS) and

1-O-a-D-Glucopyranosyl-D-mannitol dihydrat (1,1-GPM)

64519-82-0

6-O-a-D-Glucopyranosyl-D-sorbitol: C₁₂H₂₄O₁₁

1-O-a-D-Glucopyranosyl-D-mannitol dihydrate: C₁₂H₂₄O₁₁.H₂O

...

...

...

1,1-GPM (without molecules of crystal water)

6-O-a-D-Glucopyranosyl-D-sorbitol: 344,32

1-O-a-D-Glucopyranosyl-D-mannitol dihydrat: 380,32

Odourless, white, crystalline slightly hygroscopic substance.

Sweetener, bulking agent, anticaking agent, glazing agent

Freely soluble in water, very slightly soluble in ethanol.

Passes test (See description under Tests).

...

...

...

Not more than 0,05%. (Test 5 g of the sample).

Not more than 3%.

Not more than 6%.

Not more than 0,3%.

Not more than 2 mg/kg.

Not more than 1 mg/kg.

Not less than 98% of hydrogenated mono- and disaccharides and not less than 86% of the mixture of 6-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-sorbitol and 1-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-mannitol on the anhydrous basis.

...

...

...

TLC aluminium foils or plates of approx. 12 cm length and coated with a layer of approx. 0.2 mm, Kieselgel 60 F254, Art. 5554, Merck, or equivalent.

Standard solution:

Dissolve 500 mg of each of the following sugar alcohols in 100 ml of water: Sorbitol, mannitol, lactitol, maltitol, 1-O-alpha-D-gluco-pyranosylD-mannitol (1,1-GPM), and 6-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-sorbitol (1,6- GPS)

Test solution:

Dissolve 500 mg of sample in 100 ml of water.

Solvent A:

Isopropanol:n-butanol:aqueous boric acid solution (25 mg/ml):acetic acid:propionic acid (50:30:20:2:16;v/v)

Solvent B :

Ethylacetate:pyridine:water:acetic acid:propionic acid (50:50:10:5:5;v/v).

...

...

...

I: 0.1% Na-metaperiodate in water (w/w).

II: ethanol:sulfuric acid:anisaldehyde:acetic acid (90:5:1:1;v/v).

Procedure

Apply approximately 0.3 µl each of the reference and test solution to the bottom of the TLC plate. Dry the spots in warm air. Develop the plate to a height of 10 cm in a developing chamber containing either solvent A or solvent B. Allow the plate to dry in warm air and dip the plate for up to 3 sec into Detecting solution I.

 Dry the plate in hot air. Note: The plate should be completely dry on both sides. Dip the plate in Detecting solution II up to 3 sec and dry in hot air until coloured spots become visible. Optionally, the background colour may be brightened in warm steam.

The approximate R_f values and colours of the spots on the TLC-plate of the substances are described as follows:

Substance

color

R_f (in solvent A)

...

...

...

Mannitol

reddish (light)

0,36

0,40

Sorbitol

brown

0,36

0,36

GPM

...

...

...

0,28

0,16

GPS

blue-grey

0,25

0,13

Maltitol

green

0,26

...

...

...

Lactilol

olive-green

0,23

0,14

The R_f values may vary slightly depending on the commercial source of the silica gel plates.

The principal spots in the chromatogram obtained from a test solution of isomalt are similar in R_f value and colour to GPM and GPS.

Tested under JECFA monograph 1 - Vol.4- Proceed as directed under Reducing Substances (as glucose), Method II. The weight of cuprous oxide shall not exceed 50 mg.

Test solution:

...

...

...

Standard solutions:

Prepare three Standard solutions in the same manner as the Sample solution but adding 0.5 ml, 1.0 ml, and 1.5 ml, respectively, of a standard nickel solution containing 10 mg/kg Ni, in addition to the 20.0 g of the sample.

Procedure:

Zero the instrument by measuring the methyl isobutyl ketone solution (Prepare in the same manner as the Sample solution, but omit the sample).  Measure the absorbances of the methyl isobutyl ketone solution extracted at 232.0 nm, use a nickel hollow cathode lamp and an air–acetylene flame.

Tested under JECFA monograph 1 - Vol.4. Determine using an atomic absorption technique appropriate to the specified level. The selection of sample size and method of sample preparation may be based on the principles of the method described in JECFA monograph 1 - Vol.4 “Instrumental Methods.”

Internal standard solution

Dissolve suitable quantities of phenyl-ß-D-glucopyranoside and maltitol in water to obtain a solution of about 1 mg phenyl-ß-D-glucopyranoside and 50 mg maltitol per g water.

Standard solutions

Dissolve accurately weighed quantities of 1-O-alpha-D-glucopyranosylD-mannitol (1,1-GPM) and 6-O-alpha-D-glucopyranosyl-D-sorbitol (1,6- GPS), calculated as dry substance, in water to obtain two separate solutions having a concentration of about 50 mg per g each. Also prepare an aqueous standard solution containing approx. 1 mg mannitol and 1 mg sorbitol per g.

...

...

...

Dissolve an accurately weighed quantity of the sample (approx. 1 g) in water to obtain a concentration of about 10 g per 100 g.

Procedure

Pipet 100.0 mg of standard solution or sample solution into a glass tube fitted with a screw cap and add 100.0 mg of internal standard solution. Remove the water by lyophilization and dissolve the residue in 1.0 ml of pyridine. Add 4 mg O-benzyl-hydroxylamine hydrochloride, and cap the tube and set it aside for 12 h at room temperature. Then, add 1 ml of Nmethyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamide (MSTFA) and heat to 80º for 12 h shaking occasionally and allow to cool. Inject 1 µl portions of these solutions directly into a gas chromatograph under the following operating conditions:

Carrier gas: Helium (initial flow rate: approx. 1 ml/min at 80ºC and 1 atm; split flow: 25 ml/min)

Column: Fused silica HT-8 (25 m x 0.22 mm x 0.25 µm), or equivalent;

Injector: Programmed temperature vaporizer: 30ºC; 270º/min to 300ºC (49 min)

Detector: Flame ionization detector; 360ºC;

Temperature program: 80º (3 min); 10º/min to 210º; 5º/min to 300º (6 min)

Approximate retention times:

...

...

...

Mannitol 19.5 min

Sorbitol 19.6 min

Internal standards:

Phenyl-ß-D-glucopyranoside 26.8 min

Maltitol 33.5 min

Hydrogenated disaccharides (32 - 36 min)

1,1-GPS 33.9 min

1,1-GPM 34.5 min

1,6-GPS 34.6 min

...

...

...

Where:

a_I = peak area of component I (µV·s)

a_S = peak area of internal standard (µV·s)

m_S = mass of internal standard used for derivatization (mg d.s.)

m_ISOMALT = mass of sample used for derivatization (mg d.s.)

F_I = relative response factor fI/fS

f_I = response factor of component I: fI =(aI/mI)x(100/% purity)

f_S = response factor of internal standard: fS =(aS/mS)x(100/% purity)

...

...

...

NOTE: Use maltitol as internal standard for the calculation of hydrogenated disaccharides (e.g. 1,1-GPM, 1,6-GPS) and phenyl-ß-Dglucoside for the calculation of hydrogenated monosaccharides (mannitol, sorbitol). For the total of other saccharides (hydrogenated or not), subtract the sum of 1,1-GPM, 1,6-GPS, sorbitol and mannitol from 100%.)

ANNEX 4

SPECIFICATIONS AND TESTS FOR SACCHARIN

INS 954

ADI = 0 - 5 mg/kg bw

1,2-Benzisothiazole-3(2H)-one-1,1-dioxide;

3-oxo-2,3- dihydrobenzo[d]isothiazol-1,1-dioxide

...

...

...

C₇H₅NO₃S

183,18

White crystals or a white, crystalline powder, odourless or with a faint, aromatic odour

Sweetener

Slightly soluble in water; soluble in basic solutions; sparingly soluble in ethanol.

A saturated aqueous solution is acidic.

Passes test (See description under Tests).

...

...

...

Not more than 1% (105^oC , 2 h)

226 - 230^oC.

Not more than 0.2% (Test 2 g of the sample).

Passes test (See description under Tests).

Passes test (See description under Tests).

Not more than 25 mg/kg.

Not more than 30 mg/kg.

Not more than 1 mg/kg.

...

...

...

Dissolve about 0.1 g of the sample in 5 ml of 5% sodium hydroxide solution. Evaporate to dryness and gently fuse the residue over a small flame until it no longer evolves ammonia. After the residue has cooled, dissolve it in 20 ml of water, neutralize the solution with dilute hydrochloric acid TS and filter. The addition of a drop of ferric chloride TS to the filtrate produces a violet colour.

Mix 20 mg of the sample with 40 mg of resorcinol, add 10 drops of sulfuric acid, and heat the mixture in a liquid bath at 200º for 3 min. After cooling, add 10 ml of water and an excess of sodium hydroxide TS. A fluorescent green liquid is produced.

Add ferric chloride TS dropwise to 10 ml of a hot, saturated solution of the sample. No precipitate or violet colour appears.

Dissolve 0.2 g of the sample in 5 ml of sulfuric acid TS. Keep at 48^o to 50^o for 10 min. The colour should not be darker than a very light brownish-yellow (Matching Fluid A).

Tested under JECFA monograph 1 - Vol.4- Proceed as directed under monograph Selenium Limit Test, Method I, Test 0.2 g of the sample.

Tested under JECFA monograph 1 - Vol.4. Determine using an atomic absorption technique appropriate to the specified level. The selection of sample size and method of sample preparation may be based on the principles of the method described in JECFA monograph 1 - Vol.4 “Instrumental Methods.”

...

...

...

Each ml of 0.1 N sodium hydroxide is equivalent to 18.32 mg of C₇H₅NO₃S.

ANNEX 5

SPECIFICATIONS AND TESTS FOR SORBITOL

D-Glucitol, D-Sorbitol, Sorbol

INS 420

ADI “Not limited”

D-Sorbitol

...

...

...

C₆H₁₄O₆

182,17

White hygroscopic powder, crystalline powder, flakes or granules

Sweetener, humectant, texturizer, stabilizer, bulking agent

Very soluble in water, slightly soluble in ethanol.

88 – 102 ^oC.

Passes test (See description under Tests).

...

...

...

Not more than 1% (Karl Fischer Titrimetric Method)

Not more than 0.1%

Chlorides

Not more than 50 mg/kg

Not more than 100 mg/kg

Nickel

Not more than 2 mg/kg

Not more than 0.3%

Not more than 1.0% (as glucose)

...

...

...

Not less than 97.0% of C₆H₁₄O₆ of total glycitols and not less than 91.0% of D-sorbitol on the anhydrous basis. The term glycitols refers to compounds with the structural formula CH₂OH-(CHOH)_n-CH₂OH, n £ 4.

Proceed as directed under Thin Layer Chromatography of Polyols under JECFA monograph 1 - Vol.4.

Use the following:

Standard solution

Dissolve 50 mg of reference standard sorbitol (USP) in 20 ml water

Test solution

Dissolve 50 mg of the sample in 20 ml of water

...

...

...

Tested under JECFA monograph 1 - Vol.4- Test 10 g of sample by the Limit Test using 1.5 ml of 0.01N hydrochloric acid in the control.

Tested under JECFA monograph 1 - Vol.4- Test 10 g of sample by the Limit Test using 2.0 ml of 0.01N sulfuric acid in the control.

Tested under JECFA monograph 1 - Vol.4- Reducing Substances (as glucose), Method II. The weight of cuprous oxide shall not exceed 50 mg.

Transfer 2.1 g of the sample into a 250 ml flask fitted with a ground glass joint, add 40 ml of 0.1N hydrochloric acid, attach a reflux condenser, and reflux for 4 h. Transfer the solution to a 400 ml beaker, rinsing the flask with about 10 ml of water, neutralize with 6N sodium hydroxide and proceed as directed under Reducing Substances (as Glucose) Method II. The weight of cuprous oxide shall not exceed 50 mg.

Tested under JECFA monograph 1 - Vol.4.Determine using an atomic absorption technique appropriate to the specified level. The selection of sample size and method of sample preparation may be based on the principles of the method described in JECFA monograph 1 - Vol.4 “Instrumental Methods.”

Determine the polyol content of the sample using liquid chromatography (see JECFA monograph 1 - Vol.4).

Apparatus

Liquid chromatograph (HPLC)

Detection: differential refractometer maintained at constant temperature Integrator recorder

...

...

...

Column: AMINEX HPX 87 C (resin in calcium form), length 30 cm, internal diameter 9 mm

Eluent: double distilled degassed water (filtered through Millipore membrane filter 0.45 µm)

Chromatographic conditions

Column temperature: 85±0.5^o

Eluent flow rate: 0.5 ml/min

Standard solution

Dissolve an accurately weighed quantity of sorbitol in water to obtain a solution having known concentration of about 10.0 mg of sorbitol per ml.

Test solution

Transfer about 1 g of the sample accurately weighed to a 50 ml volumetric flask, dilute with water to volume and mix.

...

...

...

Separately inject equal volumes (about 20 µl) of the sample solution and the standard solution into the chromatograph. Record the chromatograms and measure the responses of each peak. Calculate separately the quantities, in mg, of sorbitol in the portion of sample taken by the following formula:

Where:

C = s the concentration, in mg per ml, of sorbitol in the standard solution

A_t = the peak response of the sample solution

A_c = the peak response of the standard solution.

Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia QCVN 4-8:2010/BYT về phụ gia thực phẩm - chất ngọt tổng hợp do Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành